Summary
Molekylär skyttlar bestående av functionalized mikrotubuli glida på ytan, följt kinesin motorproteiner kan fungera som en nanoskala transportsystem. Här är den församling av en typisk transfer system som beskrivs.
Abstract
Celler har utvecklats sofistikerade molekylära maskiner, t.ex. kinesin motorproteiner och filament mikrotubuli, för att stödja aktiva intracellulära transport av gods. Medan kinesins svans domän binder till olika laster, kinesins huvudet domäner utnyttja kemisk energi som lagras i ATP-molekyler till steg längs mikrotubuli gitter. Den långa, styva mikrotubuli fungera som spår för långväga intracellulära transporter.
Dessa motorer och trådar kan också vara anställd i mikrofabricerade syntetiska miljöer som komponenter av molekylära pendlar 1. I en ofta använd konstruktion, kinesin motorer förankras i körbanan genom sina svansar, och functionalized mikrotubuli fungera som last transporterar element, som drivs av dessa motorer. Dessa skyttlar kan laddas med last genom att utnyttja de starka och selektiv bindning mellan biotin och streptavidin. De viktigaste komponenterna (biotinylerad tubulin, streptavidin och biotinylerad gods) finns kommersiellt tillgängliga.
Bygger på den klassiska inverterade motilitet analys 2, är byggandet av molekylära pendlar närmare här. Kinesin motorproteiner är adsorberade på en yta precoated med kasein, mikrotubuli polymeriserat från biotinylerad tubulin, anslutit sig till kinesin och därefter belagd med Rhodamine märkt streptavidin. ATP-koncentrationen hålls på subsaturating koncentration för att uppnå en mikrotubuli segelflygning hastighet optimalt för lastning 3. Slutligen biotinylerad fluorescein-märkta nanospheres läggs till som last. Nanospheres fäster mikrotubuli som en följd av kollisioner mellan glid mikrotubuli och nanospheres fastnat på ytan.
Protokollet kan lätt ändras för att ladda en mängd olika laster som biotinylerad DNA-4, kvantprickar 5 eller en mängd olika antigener via biotinylerad antikroppar 4-6.
Protocol
1.) Buffertar och reagenser
Dessa lösningar bör förberedas i förväg och förvaras i bekvämt stora portioner. En del av lösningen bör innehålla tillräcklig lösning för en typisk experiment och en ny alikvot bör användas för varje motilitet analys. Lagringsförhållanden och typiska storlekar alikvot nämns också i följande protokoll.
1. BRB80 buffert, (80 mm rör, 1 mM MgCl 2, 1 mm EGTA i avjoniserat destillerat (DD) vatten, pH justeras till 6,9 genom KOH)
- Fyll en 100 ml stamlösning av 0,5 M EGTA åååå vatten. Justera pH till 7,0 med 2 M NaOH-lösning.
- Fyll en 100 ml stamlösning 1 M MgCl 2 åååå vatten. Autoklav lösningen.
- Tillsätt 24,2 g av rör och 3,1 g KOH pellets i ca 800 ml dd vatten och rör om för att lösa upp. Justera pH till 6,9 med 1 M KOH-lösning. Tillsätt 2 ml 0,5 M EGTA stamlösning och 1 ml 1 M MgCl 2 stamlösning. Få upp volymen till 1000 ml med dd vatten.
- Fördela i 50 ml Falcon rör och fryser vid -20 ° C för framtida bruk. Den BRB80 röret som för närvarande används kan förvaras vid 4 ° C eller i rumstemperatur.
2. Magnesiumklorid, MgCl 2 (100 mM åååå vatten)
- Späd åååå vatten för att nå en slutlig koncentration av 100 mm.
- Alikvot (10 mikroliter volym) i 0,5 ml mikrocentrifugrör och förvara vid -20 ° C för framtida bruk
3. Guanosin-5'-trifosfat, dinatriumsalt, GTP (25 mm åååå vatten, pH justeras till 7 genom NaOH)
- Väg och lös åååå vatten och justera pH till 7 med 2 M NaOH-lösning.
- Verifiera koncentration genom att mäta UV-absorbans vid 260 nm. (Använd en extinktionskoefficienten för 11,7 x 103 m -1 cm -1).
- Alikvot (10 mikroliter volym) i 0,5 ml mikrocentrifugrör och förvara vid -20 ° C för framtida bruk.
4. Dimetylsulfoxid, DMSO
- Alikvot (10 mikroliter volym) i 0,5 ml mikrocentrifugrör och förvara vid -20 ° C för framtida bruk.
5. Taxol (1 mm i DMSO)
- Väg och lös i DMSO i dragskåp för att nå en slutlig koncentration av 1 mm.
- Alikvot (20 mikroliter volym) i 0,5 ml mikrocentrifugrör och förvara vid -20 ° C för framtida bruk.
6. D-(+)-glukos, (2 M åååå vatten)
- Väg och lös åååå vatten för att nå en slutlig koncentration av 2 M.
- Alikvot (20 mikroliter volym) i 0,5 ml mikrocentrifugrör och förvara vid -20 ° C för framtida bruk.
7. Glukosoxidas, (2 mg / ml i BRB80)
- Lös i BRB80 att nå en slutlig koncentration om 2 mg / ml.
- Alikvot (20 mikroliter volym) i 0,5 ml mikrocentrifugrör och förvara vid -20 ° C för framtida bruk.
8. Dithiothreitol, DTT (1 M åååå vatten)
- Lös åååå vatten under dragskåp för att nå en slutlig koncentration av 1 M.
- Alikvot (20 mikroliter volym) i 0,5 ml mikrocentrifugrör och förvara vid -20 ° C för framtida bruk.
9. Katalas, (0,8 mg / ml i BRB80)
- Lös i BRB80 i minst 2 steg för att nå en slutlig koncentration av 0,8 mg / ml. Bestäm koncentrationen i varje steg genom att mäta UV-absorbans vid 276 nm och 406 nm (Använd en extinktionskoefficienten för 3,1 x 10 5 M -1 cm -1 vid 276 nm och 2,2 x 10 5 M -1 cm -1 vid 406 nm och ekvationen A = cl).
- Alikvot (20 mikroliter volym) i 0,5 ml mikrocentrifugrör och förvara vid -20 ° C för framtida bruk.
10. Adenosin-5'-trifosfat, ATP (100 mm i 100mm MgCl 2)
- Bered en stamlösning på 100 mm MgCl 2 åååå vatten. Väg upp pulver och lös i detta bestånd lösning för att uppnå en slutlig koncentration av 100 mm.
- Verifiera koncentration genom att mäta UV-absorbans vid 260 nm. (Använd en extinktionskoefficienten för 15,4 x 10 3 M -1 cm -1).
- Alikvot (20 mikroliter volym) i 0,5 ml mikrocentrifugrör och förvara vid -20 ° C för framtida bruk.
11. Kasein lösning (20 mg / ml kasein i BRB80)
- Tillsätt cirka 3 g kasein till 30 ml dd vatten i en 50 ml Falcon rör. Vortex i cirka 1 timme tills lösningen utvecklar tjock konsistens.
- Centrifugera vid ca 15000 g under 30 minuter. Filtrera supernatanten genom 0,5 mm och 0,2 ìm filter spruta.
- Bestäm koncentrationen av supernatanten genom att mäta UV-absorbans vid 280 nm (Använd en extinktionskoefficienten för 0,67 ml mg -1 cm -1). Späd ut den till 20 mg / ml i BRB80.
- Alikvot (20 mikroliter volym) itill 0,5 ml mikrocentrifugrör och förvara vid -20 ° C för framtida bruk.
2.) Standard Solutions
Dessa är beredda på dagen för experimentet och bör kasseras efter experimentet är över. Bered 1 ml av varje.
1. BRB80CS0.5
- Späd kasein lösning i BRB80 till en slutlig koncentration på 0,5 mg / ml och lagra över is. Denna lösning införs i flödescellen före kinesin och hjälper till att behålla kinesin aktivitet efter yta adsorption.
2. BRB80CA
- Förbered 0,2 mg / ml kasein och 1 mm ATP i BRB80 och lagra över is. Kinesin är spädas ytterligare med hjälp av denna lösning före införseln till flödet cellen.
3. BRB80T
- Späd Taxol lösning i BRB80 till en slutlig koncentration av 10 mikrometer och förvara i rumstemperatur. Denna lösning används för att stabilisera mikrotubuli.
4. BRB80CT
- Förbered 10 mikroM Taxol och 0,2 mg / ml kasein i BRB80 och förvara i rumstemperatur. Detta används för att ta fram de antifade och lösningar mikrotubuli.
5. BRB80AF
- Förbered 20 mm D-glukos, 20 mikrogram / ml glukos oxidas, 8 mikrogram / ml katalas, 10 mm DTT och 20 mikroM ATP i BRB80CT och förvara i rumstemperatur. Denna lösning används för att späda streptavidin och nanospheres och "tvätta bort" överskottet streptavidin i flödet cellen. Den kinesin hastigheten kan regleras genom justering av ATP-halten i denna lösning.
3.) Kinesin Förberedelser
- Express en kinesin konstruktion bestående av vildtyp, full längd Drosophila melanogaster kinesin tung kedja och en C-terminal Hans-taggen i Escherichia coli och rena med en Ni-NTA kolumnen som beskrivs i 6.
- Gör alikvoter (10 mikroliter vardera) i 0,5 ml rör mikrocentrifug och förvara vid -80 ° C för framtida bruk. Koncentrationen av aktiva kinesin i dessa portioner är ca 200 nm. 7
- För ett typiskt experiment späda kinesin lösning 20 gånger i BRB80CA. Etikett lösningen KIN20 och lagra över is.
4.) Mikrotubuli Förberedelser
- I ett 0,5 ml mikrocentrifugrör, förbereda 25 mikroliter av tillväxt lösning: 4 mm MgCl 2, 1 mm GTP och 5% DMSO (v / v) i BRB80 buffert.
- Tillsätt 6,25 mikroliter av denna lösning till en 20 mikrogram alikvot av frystorkat biotinylerad tubulin.
- Vortex, placera sedan i en värme bad vid 37 ° C i 30 minuter för att polymerisera. Späd 100-faldig i BRB80T och skaka försiktigt. Etikett lösningen MT100 och förvara i rumstemperatur.
- Gör en 10 faldig utspädning av MT100 i BRB80AF. Märk lösningen MT1000.
5.) Streptavidin och NanoSphere lösning
Förbered AlexaFluor568-märkta streptavidin vid en koncentration av 100 nm BRB80AF. Label det STV100 och förvara på is. Likaså, späd nanospheres 5000 gånger i BRB80AF lösning. Label det NS5000 och förvara på is.
6.) Flöde Cellkonstruktion
Konstruera ett flowcell med två glas täckglas separerade med dubbelhäftande tejp. Detta flöde cell är ca 2 cm lång, 1 cm breda och 100 ìm hög och har en volym på cirka 20 mikroliter. Lösningar förs in i flödet cellen från den ena sidan med hjälp av en pipett och elak ut från de andra med hjälp av filtrerpapper.
7.) Inverterad analys Montering
Glasytan är först belagd med kasein som gör kinesin att behålla sin funktion på adsorption. Efter kinesin adsorberas är mikrotuberna introduceras, som innehas av kinesin. Mikrotubuli är sedan belagda med fluorescerande streptavidin. Efter tvättning ut överflödigt streptavidin är biotinylerad polystyren fluorescein nanospheres (40 nm diameter) introduceras. Yta adsorberat stationära nanospheres kolliderar med rörliga mikrotubuli och få lastas på dem (figur 1).
Ordningsföljden på flödet av lösningar och tillåten tid före införandet av nästa lösning är listade nedan.
- BRB80CS0.5, 5 minuter
- KIN20, 5 minuter
- MT1000, 5 minuter
- STV100, 5 minuter
- BRB80AF, 3x
- NS5000
8.) Mikroskopi
Montera flödescell på mikroskop scenen direkt efter NanoSphere introduktion. I detta experiment, en Eclipse TE2000-U fluorescensmikroskop (Nikon, Melville, NY) utrustad med ett 100X olja mål (NA 1,45), en X-cite 120 lampa (EXFO, Ontario, Kanada) och en iXon EMCCD kamera (Andor, South Windsor, CT) använts. En FITC-filter kub (# 48.001) och en TRITC filter kub (# 48.002, Chroma Technologies, Rockingham, VT) användes för att bilden nanospheres och mikrotubuli respectitivt på undersidan av flödet celler. Exponeringstiden var 0,2 s, medan tiden mellan exponeringarna var 2 S.
Figur 1. Schematisk bild av molekylära pendlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Med smärre modifieringar har detta protokoll använts framgångsrikt av olika grupper att montera kinesin-mikrotubuli baserade motilitet analyser. 10 mM DTT i den slutliga motilitet lösningen kan ersättas med 0,5% β-merkaptoetanol. Standardlösningar (BRB80AF, KIN20 och MT1000) mer än 2 timmar gammal bör inte användas. Varje lösning innehållande Taxol och särskilt mikrotubuli får aldrig placeras på is. Överdriven exponering av flödescellen för UV-resultat excitation ljus i fotoskador till den funktionella komponenter:. Mikrotubuli och kinesin 8 Denna effekt är ännu mer uttalad om flödet cellen innehåller polymerer med hög syre diffusivitet såsom polystyren nanospheres 9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Vi är kraftigt skuldsatt Jonathon Howard, vars grupp utvecklat den grundläggande protokollet för en segelflygning motilitet test som sedan anpassats av oss. Ekonomiskt stöd från NSF bevilja DMR0645023 är tacksamt erkänns.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenosine-5’-triphosphate (ATP) | Invitrogen | A1049 | |
| Biotin tubulin | Cytoskeleton, Inc. | T333 | |
| Casein | Sigma-Aldrich | C-0376 | |
| Catalase | Sigma-Aldrich | C-9322 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G-7528 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D-8779 | |
| Dithiotreitol (DTT) | Bio-Rad | 161-0610 | |
| Ethylene glycol-bis(2-amin–thylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | E-4378 | |
| FluoSpheres Biotinylated microspheres, 40 nm, yellow-green fluorescent (505/515) | Invitrogen | F-8766 | |
| Glucose oxidase | Sigma-Aldrich | G-7016 | |
| Guanosine-5’-triphosphate (GTP) | Roche Group | 106399 | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | 63069 | |
| Paclitaxel (Taxol) | Sigma-Aldrich | T1912 | |
| 1,4-Piperazinediethanesulfonic acid, Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid), Piperazine-N,N′-bis(2-ethanesulfonic acid) (PIPES) | Sigma-Aldrich | P-6757 | |
| Potassium hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | P-6310 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | 480878 | |
| Streptavidin Alexa Fluor 568 conjugate | Invitrogen | S11226 |
References
- Agarwal, A., Hess, H. Biomolecular motors at the intersection of nanotechnology and polymer science. Progress in Polymer Science. 35 (1-2), 252-252 (2010).
- Howard, J., Hunt, A. J., Baek, S. Assay of microtubule movement driven by single kinesin molecules. Methods Cell Biol. 39, 137-137 (1993).
- Agarwal, A., Katira, P., Hess, H. Millisecond curing time of a molecular adhesive causes velocity-dependent cargo-loading of molecular shuttles. Nano Lett. 9 (3), 1170-1170 (2009).
- Diez, S., Reuther, C., Dinu, C., Seidel, R., Mertig, M., Pompe, W., Howard, J. Stretching and Transporting DNA Molecules Using Motor Proteins. Nano Lett. 3 (9), 1251-1251 (2003).
- Bachand, G. D., Rivera, S. B., Boal, A. K., Gaudioso, J., Liu, J., Bunker, B. C. Assembly and transport of nanocrystal CdSe quantum dot nanocomposites using microtubules and kinesin motor proteins. Nano Lett. 4 (5), 817-817 (2004).
- Coy, D. L., Wagenbach, M., Howard, J. Kinesin takes one 8-nm step for each ATP that it hydrolyzes. J. Biol. Chem. 274 (6), 3667-3667 (1999).
- Katira, P., Agarwal, A., Fischer, T., Chen, H. -Y., Jiang, X., Lahann, J., Hess, H. Quantifying the performance of protein-resisting surfaces at ultra-low protein coverages using kinesin motor proteins as probes. Advanced Materials. 19, 3171-3171 (2007).
- Vigers, G. P. A., Coue, M., McIntosh, J. R. Fluorescent Microtubules Break Up Under Illumination. J. Cell Biol. 107, 1011-1011 (1988).
- Brunner, C., Hess, H., Ernst, K. -H., Vogel, V. Lifetime of biomolecules in hybrid nanodevices. Nanotechnology. 15 (10), S540-S540 (2004).
