Overview
يظهر هذا الفيديو طريقة لاختبار نقص الأكسيجة في يرقات دروسوفيلا من خلال تقييم قدراتها على التجشؤ والنفق. باستخدام هذه التقنية يمكن للباحثين التمييز بين اليرقات التي تعاني من الحرمان من الأكسجين وتلك التي تعاني من عجز في النمو. يوضح البروتوكول المثال الإعداد لهذا المقايسة.
Protocol
هذا البروتوكول هو مقتطف من تشيانغ وآخرون، A التجشؤ / نفق المقايسة للكشف عن نقص الأكسيجة في يرقات Drosophila melanogaster ، J. Vis. Exp. (2018).
1. إعداد اليرقات
- قبل يومين أو أكثر من بدء الفحص ، قم بإعداد الصلبان من المجموعات التجريبية والتحكمية المطلوبة (الحد الأدنى 20 أنثى و 10 ذكور لكل منهما) في أطباق وضع البيض كما وصفها Wieschaus و Nusslein-Volhard ولكن باستخدام 50 مل من أكواب البولي بروبلين وأطباق بيتري القابلة للتصرف 6.0 سم التي تحتوي على أجار العنب ولطخت مع معجون الخميرة قبل الاستخدام مباشرة. الحفاظ على الذباب في أطباق البيض وضع في الظلام في درجة حرارة الغرفة حتى الحاجة.
- وصفة أجار العنب – الجمع بين 100 مل المجمدة 100٪ عصير العنب التركيز, 350 مل من الماء deioinized, 5 مل الخليك الجليدي و 13 ز D. melanogaster أجار في كوب زجاجي 1L. الميكروويف في رشقات نارية 1-2 دقيقة، واثارة بين رشقات نارية، حتى يذوب كل أجار. تبريد الحل لبضع دقائق ثم إضافة 10 مل من 10٪ (ث / الخامس) من Nipagen (ميثيل ف هيدروكسيبنزوات) في الإيثانول 95٪. مزيج، ثم ماصة 7 مل لكل لوحة في المتاح 6.0 سم أطباق بيتري، والسماح لهلام وجافة في درجة حرارة الغرفة لمدة 3-4 ساعة. يخزن عند درجة حرارة 4 درجات مئوية في أكياس بلاستيكية.
- وصفة معجون الخميرة – 7 غرام الخميرة المجففة, 10 مل ماء deionized, مزيج مع ملعقة حتى اتساق موحد.
- مجموعات البيض في الوقت المناسب لتوليد اليرقات التجريبية والسيطرة عليها. باستخدام جديدة، الخميرة لطخت، لوحات العنب، وجمع البيض في درجة حرارة الغرفة لمدة 4 ساعات في الظلام خلال ساعات الصباح. إزالة هذه لوحات جمع 4 ساعة واستبدال لوحات جديدة. احتضان لوحات جمع 4 ساعة بين عشية وضحاها في 25 درجة مئوية حتى بعد ظهر اليوم التالي، عندما تكون معظم اليرقات قد فقست. جمع هذه اليرقات نجمة الأولى واستخدامها لإعداد التجربة.
2. إعداد لوحات المقايسة
- إعداد لوحات المقايسة. لتشغيل واحد من المقايسة ، قم بإعداد خمس لوحات مقايسة لكل من 10 يرقات تجريبية وخمس لوحات من 10 يرقات مراقبة. استخدام بورر الفلين 1.5 سم لإزالة نواة مركزية من أجار من كل لوحة خلق حفرة للغذاء. وضع معجون الخميرة (0.8 - 0.9 غرام) في الحفرة وبات بلطف مع ملعقة لجعل تلة ملء الحفرة.
- إعداد لوحة أغار – الجمع بين 700 مل المياه deionized مع 16 غرام D. melanogaster أجار في كوب زجاجي 2L والميكروويف لمدة 5 دقائق. إزالة من الميكروويف ويحرك مع قضيب زجاجي لجلب أجار غير المحلول في الحل. إضافة 17.5 مل من 10٪ (ث / v) Nipagen في الإيثانول 95٪، مزيج، ثم مواصلة التدفئة الميكروويف في رشقات نارية 30 ق تليها اثارة، حتى يذوب تماما كل أجار. تبرد لمدة دقيقة أو دقيقتين، ثم ماصة 15 مل aliquots في 10 سم أطباق بيتري البلاستيكية. السماح أجار لهلام، وتغطي لوحات مع الأغطية والسماح لهم الجافة في درجة حرارة الغرفة لبضع ساعات أو بين عشية وضحاها. تخزين لوحات في أكياس بلاستيكية مختومة في 18 درجة مئوية.
الملاحظة 1: لتجنب تشكيل بلورات Nipagen على سطح الصفائح بسبب الديسكتشيشن الزائد ، استخدم اللوحات في غضون أيام قليلة من التحضير. إذا لزم الأمر ، يمكن إعادة إذابة البلورات عن طريق إسقاط عدد قليل من microliters من الكحول 95 ٪ عليها.
ملاحظة 2: دفعات من أجار يمكن أن يكون لها خصائص مختلفة gelling. يجب أن تكون لوحات الجل الجافة ثابتة للمس ومرنة بما فيه الكفاية بحيث يمكن إزالة دائرة نظيفة وسليمة من أجار عند استخدام بورر الفلين لإنشاء ثقب الطعام (انظر أعلاه). - إعداد اليرقات في لوحات المقايسة. استخدام الضغط الميكانيكي لمنحنى غيض من microspatula البلاستيك وتراجع غيض في عجينة الخميرة لتوفير "لاصقة" لالتقاط اليرقات. التقط يرقات النجوم الأولى بشكل فردي ووضعها على طبق أجار بالقرب من تلة الطعام. إعداد ما لا يقل عن خمس لوحات تكرار من 10 يرقات لكل من الأنماط الجينية التجريبية والسيطرة. وبمجرد الانتهاء من ذلك، غطاء وتسمية كل لوحة وتعيين لوحات (غطاء الجانب حتى) في مساحة مظلمة في درجة حرارة الغرفة (في مختبرنا هذا هو 22 درجة مئوية).
3. رصد لوحات المقايسة
- فحص لوحات يوميا تحت المجهر تشريح وتسجيل عدد من اليرقات على رأس الطعام أو على سطح أجار. لاحظ أي يرقات ميتة أو تحتضر مرئية. لاحظ متى ، وإذا ، ينظر إلى النفق في ركيزة أجار على أنها يرقات تنتقل إلى النجم الثالث. لاحظ التواريخ التي تبدأ pupae لتشكيل وملاحظة أي تشوهات pupal. استمر في الملاحظات اليومية حتى تموت جميع اليرقات أو تقطر.
- إزالة الخوخ بعناية من لوحة مع إبرة إغاظة عازمة ونقلها إلى لوحة العنب. إذا رغبت في ذلك، ومواصلة رصد الخوادر لتحديد عدد eclose كبالغين.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Dehydrated yeast | |||
| Frozen grape juice concentrate | Welch's | Available at most large supermarkets | |
| Glacial acetic acid | Sigma-Aldrich | 320099 | |
| Drosophila agar | Apex Bioresearch Products | 66-103 | |
| Methyl-para-hydroxybenzoate | Apex Bioresearch Products | 20-658 | |
| EQUIPMENT | |||
| 50 ml polypropylene beakers | |||
| 6.0 cm disposable Petri dishes | Falcon | 08757100B | |
| 10 cm disposable plastic Petri dishes | E+K Scientific | EK-24104 | |
| Plastic microspatulas | Corning Incorporated | 3012 | |
| Bent teasing needle | Nasco | S08848MH | |
| Dissecting microscope | Any microscope with 10-30X magnification |
