Overview
这段视频展示了一种通过评估其挖洞和隧道能力来测试 果 蝇幼虫缺氧的方法。利用这项技术，研究人员可以区分缺氧的幼虫和发育缺陷的幼虫。示例协议演示此检测的设置。
Protocol
本协议摘自强等人的摘录，《在J.Vis.Exp.（2018年）的德罗索菲拉梅拉诺加斯特拉瓦发现缺氧的洞穴/隧道分析》。
1. 幼虫的准备
- 在开始检测前两天或两天以上，在维索斯和努斯林-沃尔哈德描述的蛋芽菜肴中设置所需的实验和控制组合的十字架（每个组合至少20名女性和10名男性），但使用50 mL聚丙烯烧瓶和6.0厘米一次性培养皿，其中含有葡萄醋，并在使用前涂上酵母酱。在室温下，在黑暗中将苍蝇放在蛋盘中，直到需要为止。
- 葡萄醋配方-结合100毫升冷冻100%葡萄汁浓缩物，350毫升脱碘水，5毫升冰川醋和13克 德拉诺加斯特 agar在1L玻璃烧杯。微波在1-2分钟的爆裂，在爆裂之间搅拌，直到阿加全部溶解。冷却溶液几分钟，然后在 95% 乙醇中加入 10% （w/v） 的尼帕肯 （甲基-p-羟基苯甲酸酯） 。混合，然后每盘7毫升的移液器放入一次性6.0厘米的培养皿中，在室温下凝胶和干燥3-4小时。存放在4°C的塑料袋中。
- 酵母糊配方-7克干酵母，10 mL除离子水，与铲子混合，直到均匀的一致性。
- 有时间收集卵子以生成实验和控制幼虫。使用新的酵母涂抹的葡萄盘，在早晨的黑暗中在室温下收集鸡蛋4小时。取下这些 4 h 收集板，代之以新鲜板。在25°C的夜间孵化4小时收集板，直到第二天下午，当大多数幼虫将孵化。收集这些第一个星内幼虫，并使用它们来设置实验。
2. 设置检测板
- 准备检测板。对于单次运行的检测，准备5个检测板，每个10个实验幼虫和5个板的10个控制幼虫。使用 1.5 厘米软木孔从每个盘子中取出一个中心核心，为食物创建一个孔。将酵母糊（0.8 - 0.9 g）放入孔中，用铲子轻轻拍拍，使土堆填满孔。
- Agar板制备-将700毫升的除离子水与16克 D.黑色素加 在2L玻璃烧杯和微波炉中5分钟。从微波炉中取出，用玻璃棒搅拌，将未溶解的 agar 放入溶液中。在 95% 乙醇中加入 10% （w/v） Nipagen 的 17.5 mL，混合，然后在 30s 突发中继续微波加热，然后搅拌，直到所有 agar 完全溶解。冷却一两分钟，然后将15 mL的移液器放入10厘米的塑料培养皿中。让阿加凝胶，盖上盖子的盘子，让它们在室温下干燥几个小时或过夜。在 18 °C 处将盘子存放在密封塑料袋中。
注1： 为了避免由于过度干燥而在板表面形成尼帕金晶体，请在准备后的几天内使用板。如有必要，晶体可以通过向晶体中滴下几微升95%的酒精来重新溶解。
注2： 一批阿加可以有不同的凝胶特性。干燥的凝胶板应牢固的触摸和足够的弹性，以消除干净，完整的圆的阿加可以删除时，使用软木孔创建食物孔（见上文）。 - 在检测板中设置幼虫。使用机械压力弯曲塑料微铲的尖端，并将尖端浸入酵母糊中，为拾取幼虫提供"粘合剂"。先单独捡起星内幼虫，然后放在靠近食物土堆的阿加盘子上。为实验和控制基因型准备至少5个复制板的10个幼虫。完成后，盖上每个盘子并贴上标签，并在室温下将板（盖面向上）设置在黑暗空间中（在我们的实验室中，这是 22 °C）。
3. 监测检测板
- 每天在解剖显微镜下检查板块，并记录食物顶部或在阿加表面的幼虫数量。注意任何可见的死亡或垂死的幼虫。注意何时，如果，隧道进入阿加亚地层被视为幼虫移动到第三星。注意普佩开始形成的日期，并注意任何脓包异常。继续每日观察，直到所有幼虫死亡或幼崽死亡。
- 用弯曲的调戏针小心地从盘子中取出幼崽，并转移到葡萄盘上。如果需要，继续监测脓肿，以确定成年后有多少电子关闭。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Dehydrated yeast | |||
| Frozen grape juice concentrate | Welch's | Available at most large supermarkets | |
| Glacial acetic acid | Sigma-Aldrich | 320099 | |
| Drosophila agar | Apex Bioresearch Products | 66-103 | |
| Methyl-para-hydroxybenzoate | Apex Bioresearch Products | 20-658 | |
| EQUIPMENT | |||
| 50 ml polypropylene beakers | |||
| 6.0 cm disposable Petri dishes | Falcon | 08757100B | |
| 10 cm disposable plastic Petri dishes | E+K Scientific | EK-24104 | |
| Plastic microspatulas | Corning Incorporated | 3012 | |
| Bent teasing needle | Nasco | S08848MH | |
| Dissecting microscope | Any microscope with 10-30X magnification |
