Drosofilia Saggio di scavare e tunneling: un metodo per valutare l'ipossia tissutale nelle larve di mosca

Overview

Questo video mostra un metodo per testare l'ipossia nelle larve di Drosophila valutando le loro capacità di scavare e tunneling. Utilizzando questa tecnica i ricercatori possono distinguere le larve che sperimentano la privazione di ossigeno da quelle con deficit di sviluppo. Il protocollo di esempio illustra l'impostazione per questo test.

Protocol

Questo protocollo è un estratto da Qiang et al., A Burrowing / Tunneling Assay for Detection of Hypoxia in Drosophila melanogaster Larvae, J. Vis. Exp. (2018).

1. Preparazione delle larve

1. Due o più giorni prima di iniziare il saggio, impostare croci delle combinazioni sperimentali e di controllo desiderate (minimo 20 femmine e 10 maschi ciascuna) in piatti di deposizione delle uova come descritto da Wieschaus e Nusslein-Volhard ma utilizzando becher in polipropilene da 50 mL e piatti petri monouso da 6,0 cm contenenti agar d'uva e spalmato con pasta di lievito poco prima dell'uso. Tieni le mosche nei piatti deporre le uova nell'oscurità a temperatura ambiente fino a quando necessario.
2. Ricetta di agar d'uva : combina 100 mL concentrato congelato al 100% di succo d'uva, 350 mL di acqua deioinizzata, acetico glaciale da 5 mL e 13 g di agar D. melanogaster in un bicchiere da 1 L. Microonde in raffiche da 1-2 minuti, mescolando tra le esplosioni, fino a quando l'agar non è tutto sciolto. Raffreddare la soluzione per alcuni minuti, quindi aggiungere 10 mL del 10% (w/v) di Nipagen (metil-p-idrossibenzoato) nel 95% di etanolo. Mescolare, quindi pipettare 7 mL per piastra in piastre di Petri monouso da 6,0 cm, lasciare gelare e asciugare a temperatura ambiente per 3-4 ore. Conservare a 4 °C in sacchetti di plastica.
3. Ricetta pasta di lievito - 7 g di lievito essiccato, 10 mL di acqua deionizzata, mescolare con una spatola fino a una consistenza uniforme.
4. Raccolte di uova a tempo per generare larve sperimentali e di controllo. Utilizzando nuovi piatti d'uva imbrattati di lievito, raccogliere le uova a temperatura ambiente per 4 ore al buio durante le ore del mattino. Rimuovere queste piastre di raccolta da 4 ore e sostituirle con piastre fresche. Incubare le piastre di raccolta di 4 ore durante la notte a 25 °C fino al pomeriggio del giorno successivo, quando la maggior parte delle larve si sarà schiusa. Raccogli queste prime larve instar e usle per impostare l'esperimento.

2. Impostazione di piastre di dosaggio

1. Preparazione di piastre di dosaggio. Per una singola corsa del saggio, preparare cinque piastre di dosaggio ciascuna di 10 larve sperimentali e cinque piastre di 10 larve di controllo. Utilizzare una borsista di sughero di 1,5 cm per rimuovere un nucleo centrale di agar da ogni piatto creando un foro per il cibo. Mettere la pasta di lievito (0,8 - 0,9 g) nel foro e accarezzare delicatamente con una spatola per fare un tumulo che riempie il foro.
2. Preparazione piastra agar - unire 700 mL di acqua deionizzata con 16 g D. melanogaster agar in un bicchiere da 2L e microonde per 5 minuti. Togliere dal microonde e mescolare con un'asta di vetro per portare l'agar non disciolto nella soluzione. Aggiungere 17,5 mL di 10% (w/v) Nipagen in etanolo al 95%, mescolare, quindi continuare il riscaldamento a microonde in raffiche da 30 s seguite da agitazione, fino a quando tutto l'agar è completamente sciolto. Raffreddare per un minuto o due, quindi pipettare aliquote da 15 mL in piastre petri di plastica da 10 cm. Lasciare gelare l'agar, coprire le piastre con coperchi e lasciarle asciugare a temperatura ambiente per alcune ore o durante la notte. Conservare le lastre in sacchetti di plastica sigillati a 18 °C.
   NOTA 1: Per evitare la formazione di cristalli di Nipagen sulla superficie delle piastre a causa dell'eccessiva essiccazione, utilizzare le piastre entro pochi giorni dalla preparazione. Se necessario, i cristalli possono essere risciolti facendo cadere alcuni microlitri di alcol al 95%.
   NOTA 2: lotti di agar possono avere diverse proprietà di gelata. Le piastre di gel secco devono essere ferme al tatto e sufficientemente resistenti da poter rimuovere un cerchio di agar pulito e intatto quando si utilizza la borsista di sughero per creare il foro alimentare (vedi sopra).
3. Impostazione delle larve nelle piastre di dosaggio. Utilizzare la pressione meccanica per curvare la punta di una microspacola di plastica e immergere la punta nella pasta di lievito per fornire "adesivo" per il prelievo delle larve. Raccogli le prime larve instar individualmente e posizionale sul piatto di agar vicino al tumulo alimentare. Preparare almeno cinque piastre replicate di 10 larve sia per genotipi sperimentali che di controllo. Una volta completato, fissare ed etichettare ogni piastra e impostare le piastre (lato coperchio verso l'alto) in uno spazio buio a temperatura ambiente (nel nostro laboratorio questo è 22 °C).

3. Monitoraggio delle piastre di dosaggio

1. Esaminare le piastre ogni giorno al microscopio di sezionamento e registrare il numero di larve sopra il cibo o sulla superficie dell'agar. Nota eventuali larve morte o morenti visibili. Si noti quando, e se, il tunneling nel substrato dell'agar è visto come le larve si spostano nella terza stella. Nota le date in cui iniziano a formarsi le pupe e nota eventuali anomalie pupali. Continuare le osservazioni quotidiane fino a quando tutte le larve sono morte o impupate.
2. Rimuovere accuratamente le pupe dal piatto con un ago da presa in giro piegato e trasferirlo in un piatto d'uva. Se lo si desidera, continuare a monitorare le pupe per determinare quanti eclose come adulti.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
Dehydrated yeast
Frozen grape juice concentrate	Welch's		Available at most large supermarkets
Glacial acetic acid	Sigma-Aldrich	320099
Drosophila agar	Apex Bioresearch Products	66-103
Methyl-para-hydroxybenzoate	Apex Bioresearch Products	20-658
EQUIPMENT
50 ml polypropylene beakers
6.0 cm disposable Petri dishes	Falcon	08757100B
10 cm disposable plastic Petri dishes	E+K Scientific	EK-24104
Plastic microspatulas	Corning Incorporated	3012
Bent teasing needle	Nasco	S08848MH
Dissecting microscope			Any microscope with 10-30X magnification