Drosophila Ensaio de escavação e tunelamento: um método para avaliar a hipóxia tecidual em larvas de mosca

Overview

Este vídeo mostra um método para testar a hipóxia em larvas de Drosophila, avaliando suas habilidades de escavação e tunelamento. Usando essa técnica, os pesquisadores podem distinguir larvas que experimentam a privação de oxigênio daquelas com déficits de desenvolvimento. O protocolo de exemplo demonstra a configuração deste ensaio.

Protocol

Este protocolo é um trecho de Qiang et al., A Burrowing/Tunneling Assay for Detection of Hypoxia in Drosophila melanogaster Larvae, J. Vis. Exp. (2018).

1. Preparação de larvas

1. Dois ou mais dias antes de iniciar o ensaio, configure cruzes das combinações experimentais e de controle desejadas (mínimo 20 fêmeas e 10 machos cada) em pratos leigos de ovos, como descrito por Wieschaus e Nusslein-Volhard, mas usando 50 mL de bicos de polipropileno e 6,0 cm de pratos descartáveis de Petri contendo ágar de uva e manchados com pasta de levedura pouco antes do uso. Mantenha moscas em pratos de ovo na escuridão à temperatura ambiente até que seja necessário.
2. Receita de ágar de uva – combine 100 mL congelado 100% concentrado de suco de uva, 350 mL de água desioinizada, 5 mL de acéstica glacial e 13 g D. melanogaster ágar em um copo de vidro 1L. Micro-ondas em rajadas de 1-2 min, mexendo entre rajadas, até que o ágar esteja todo dissolvido. Esfrie a solução por alguns minutos e adicione 10 mL de 10% (w/v) de Nipagen (metil-p-hidroxibenzoate) em 95% de etanol. Misture, em seguida, pipeta 7 mL por prato em pratos descartáveis de 6,0 cm Petri, deixe gelar e secar à temperatura ambiente por 3-4 h. Guarde a 4 °C em sacos plásticos.
3. Receita de pasta de levedura – levedura seca de 7 g, 10 mL de água desionizada, misture com uma espátula até a consistência uniforme.
4. Coleções de ovos cronometrado para gerar larvas experimentais e de controle. Usando novas placas de uva manchadas de levedura, colete ovos à temperatura ambiente por 4h na escuridão durante as horas da manhã. Remova estas placas de coleta de 4h e substitua por placas frescas. Incubar as placas de coleta de 4h durante a noite a 25 °C até a tarde do dia seguinte, quando a maioria das larvas terá eclodido. Colete essas primeiras larvas instar e use-as para configurar o experimento.

2. Configuração de placas de ensaio

1. Preparação de placas de ensaio. Para uma única execução do ensaio, prepare cinco placas de ensaio cada uma de 10 larvas experimentais e cinco placas de 10 larvas de controle. Use um borer de cortiça de 1,5 cm para remover um núcleo central de ágar de cada prato criando um orifício para o alimento. Coloque pasta de levedura (0,8 - 0,9 g) no orifício e bata suavemente com uma espátula para fazer um monte enchendo o orifício.
2. Preparação da placa de ágar – combine água deionizada de 700 mL com 16 g D. melanogaster ágar em um béquer de vidro 2L e micro-ondas por 5 min. Retire do micro-ondas e mexa com uma haste de vidro para trazer ágar não resolvido para a solução. Adicione 17,5 mL de 10% (w/v) Nipagen em 95% de etanol, misture, depois continue aquecendo micro-ondas em rajadas de 30 s seguidas de agitação, até que todo o ágar esteja completamente dissolvido. Esfrie por um minuto ou dois, depois pipeta 15 mL aliquots em placas de Petri de plástico de 10 cm. Deixe o ágar gelar, cubra as placas com tampas e deixe-os secar em temperatura ambiente por algumas horas ou durante a noite. Armazene as placas em sacos plásticos lacrados a 18 °C.
   NOTA 1: Para evitar a formação de cristais Nipagen na superfície das placas devido ao excesso de dessecação, use placas dentro de alguns dias de preparação. Se necessário, os cristais podem ser re-dissolvidos jogando alguns microliters de 95% de álcool sobre eles.
   NOTA 2: Lotes de ágar podem ter diferentes propriedades de gelagem. As placas de gel seco devem ser firmes ao toque e suficientemente resistentes para que um círculo limpo e intacto de ágar possa ser removido ao usar o borer de cortiça para criar o orifício alimentar (veja acima).
3. Instalando larvas em placas de ensaio. Use pressão mecânica para curvar a ponta de uma microspatula plástica e mergulhe a ponta na pasta de levedura para fornecer "adesivo" para pegar larvas. Pegue as primeiras larvas instar individualmente e coloque-as no prato de ágar perto do monte de comida. Prepare pelo menos cinco placas de réplica de 10 larvas para genótipos experimentais e de controle. Uma vez concluída, cap e rotule cada placa e coloque as placas (lado da tampa para cima) em um espaço escuro à temperatura ambiente (em nosso laboratório este é 22 °C).

3. Monitorando placas de ensaio

1. Examine as placas diariamente sob um microscópio dissecando e regisine o número de larvas em cima do alimento ou na superfície do ágar. Note qualquer larva visível morta ou moribunda. Note quando, e se, o túnel no substrato de ágar é visto como larvas se movem para a terceira instar. Observe datas em que pupas começam a se formar e note quaisquer anormalidades pupais. Continue observações diárias até que todas as larvas tenham morrido ou filhotes.
2. Retire a pupa cuidadosamente do prato com uma agulha de provocação dobrada e transfira para um prato de uva. Se desejar, continue monitorando pupas para determinar quantos eclose como adultos.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
Dehydrated yeast
Frozen grape juice concentrate	Welch's		Available at most large supermarkets
Glacial acetic acid	Sigma-Aldrich	320099
Drosophila agar	Apex Bioresearch Products	66-103
Methyl-para-hydroxybenzoate	Apex Bioresearch Products	20-658
EQUIPMENT
50 ml polypropylene beakers
6.0 cm disposable Petri dishes	Falcon	08757100B
10 cm disposable plastic Petri dishes	E+K Scientific	EK-24104
Plastic microspatulas	Corning Incorporated	3012
Bent teasing needle	Nasco	S08848MH
Dissecting microscope			Any microscope with 10-30X magnification