Дрозофила Берроуинг и туннелирование анализ: метод для оценки гипоксии тканей в Fly Larvae

Overview

Это видео показывает метод для проверки гипоксии в личинках дрозофилы, оценивая их способности рыться и туннелирования. Используя этот метод, исследователи могут отличить личинок, испытывающих лишение кислорода, от тех, у кого есть дефицит развития. Пример протокола демонстрирует настройку для этого анализа.

Protocol

Этот протокол является выдержкой из Цян и др.., Берринг / Туннельный анализ для обнаружения гипоксии в Drosophila меланогастер Larvae, J. Vis. Exp. (2018).

1. Подготовка личинок

1. За два или более дней до начала анализа, создать кресты желаемых экспериментальных и контрольных комбинаций (минимум 20 женщин и 10 мужчин каждый) в яйцекладке блюда, как описано Wieschaus и Nusslein-Volhard, но с использованием 50 мл полипропиленовых стаканов и 6,0 см одноразовые чашки Петри, содержащие виноградный агар и смазаны дрожжевой пастой незадолго до использования. Держите мух в яйцекладке блюда в темноте при комнатной температуре, пока это необходимо.
2. Рецепт виноградного агара – объединить 100 мл замороженного 100% концентрата виноградного сока, 350 мл дейоинизированной воды, 5 мл ледникового уксуса и 13 г агара D. melanogaster в стакане 1L. Микроволновая печь в 1-2 мин очередей, помешивая между очередями, пока агар все растворяется. Охладить раствор в течение нескольких минут, затем добавить 10 мл 10% (w/v) нипайна (метил-p-гидроксибензоат) в 95% этанола. Смешайте, затем пипетку 7 мл на тарелку в одноразовые 6,0 см петри блюда, дайте гель и высушите при комнатной температуре в течение 3-4 ч. Хранить при 4 градусов по Цельсию в полиэтиленовых пакетах.
3. Рецепт дрожжевой пасты - 7 г сушеных дрожжей, 10 мл деионизированной воды, смешать с шпателем до однородной консистенции.
4. Приумные коллекции яиц для создания экспериментальных и контроля личинок. Используя новые, смазанные дрожжами виноградные тарелки, собирайте яйца при комнатной температуре 4 ч в темноте в утренние часы. Удалите эти 4 ч пластины коллекции и заменить свежими пластинами. Инкубировать 4 ч коллекции пластин на ночь при 25 градусов по Цельсию до второй половине дня следующего дня, когда большинство личинок вылупились. Соберите эти первые личинки instar и использовать их для настройки эксперимента.

2. Настройка анализных пластин

1. Подготовка анализных пластин. Для одного запуска анализа подготовьтесь к пяти анализам пластин каждой из 10 экспериментальных личинок и пяти пластин по 10 контрольных личинок. Используйте пробковый бор диаметром 1,5 см, чтобы удалить центральное ядро агара с каждой пластины, создавая отверстие для пищи. Положите дрожжевой пасты (0,8 - 0,9 г) в отверстие и погладить осторожно шпателем, чтобы сделать курган заполнения отверстия.
2. Препарат Агар пластины - объединить 700 мл деионизированной воды с 16 г D. melanogaster агар в стакане 2L стекла и микроволновой печи в течение 5 мин. Удалить из микроволновой печи и перемешать со стеклянным стержнем, чтобы принести неразрешеный агар в раствор. Добавить 17,5 мл 10% (w/v) Nipagen в 95% этанола, перемешать, затем продолжить микроволновое отопление в 30 с очередей с последующим перемешиванием, пока все агар полностью растворяется. Охладить в течение минуты или двух, затем пипетку 15 мл aliquots в 10 см пластиковые чашки Петри. Разрешить агар гель, накрыть пластины крышками и дайте им высохнуть при комнатной температуре в течение нескольких часов или на ночь. Храните тарелки в запечатанных полиэтиленовых пакетах при 18 градусах Цельсия.
   ПРИМЕЧАНИЕ 1: Чтобы избежать образования кристаллов Нипажена на поверхности пластин из-за избыточного высыхания, используйте пластины в течение нескольких дней после приготовления. При необходимости кристаллы можно повторно растворить, сбросив на них несколько микролитров 95% алкоголя.
   ПРИМЕЧАНИЕ 2: партии агара могут иметь различные свойства гелеобразования. Сухие гелеобразные пластины должны быть твердыми на ощупь и достаточно устойчивыми, что чистый, неповрежденный круг агара может быть удален при использовании пробкового борера для создания пищевого отверстия (см. выше).
3. Настройка личинок в анализных пластинах. Используйте механическое давление, чтобы кривой кончик пластиковой микроспатулы и окунуть кончик в дрожжевой пасты, чтобы обеспечить "клей" для сбора личинок. Возьмите первые личинки instar по отдельности и поместите их на агар пластины рядом с пищевой насыпи. Подготовь как минимум пять пластин репликации по 10 личинок как для экспериментальных, так и для контрольных генотипов. После завершения, крышка и этикетки каждой пластины и установить пластины (крышка вверх) в темном пространстве при комнатной температуре (в нашей лаборатории это 22 градусов по Цельсию).

3. Мониторинг анализных пластин

1. Осматривать пластины ежедневно под рассеченным микроскопом и записывать количество личинок на верхней части пищи или на поверхности агара. Обратите внимание на любые видимые мертвые или умирающие личинки. Обратите внимание, когда и если, туннелирование в агар субстрат рассматривается как личинки перейти в третий instar. Обратите внимание на даты, на которых куколки начинают формироваться и отметить любые пупонные аномалии. Продолжайте ежедневные наблюдения до тех пор, пока все личинки не умер или не окуклились.
2. Снимите куколки с тарелки с помощью изогнутой дразня иглы и перенесите на виноградную тарелку. При желании продолжайте мониторинг куколок, чтобы определить, сколько eclose, как взрослые.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
Dehydrated yeast
Frozen grape juice concentrate	Welch's		Available at most large supermarkets
Glacial acetic acid	Sigma-Aldrich	320099
Drosophila agar	Apex Bioresearch Products	66-103
Methyl-para-hydroxybenzoate	Apex Bioresearch Products	20-658
EQUIPMENT
50 ml polypropylene beakers
6.0 cm disposable Petri dishes	Falcon	08757100B
10 cm disposable plastic Petri dishes	E+K Scientific	EK-24104
Plastic microspatulas	Corning Incorporated	3012
Bent teasing needle	Nasco	S08848MH
Dissecting microscope			Any microscope with 10-30X magnification