Overview
Bu video, Drosophila larvalarında hipoksiyi yuvalama ve tünelleme yeteneklerini değerlendirerek test etmek için bir yöntem göstermektedir. Bu tekniği kullanan araştırmacılar, oksijen eksikliği yaşayan larvaları gelişimsel eksikliği olanlardan ayırt edebilir. Örnek protokol, bu test için kurulumu gösterir.
Protocol
Bu protokol, Drosophila melanogaster Larvalarında Hipoksi Tespiti için Bir Burrowing / Tünel Tahlili, J. Vis. Exp. (2018) Qiang ve ark.'danbir alıntıdır.
1. Larvaların hazırlanması
- Teste başlamadan iki veya daha fazla gün önce, Wieschaus ve Nusslein-Volhard tarafından tanımlandığı gibi yumurta döşeme kaplarında istenen deneysel ve kontrol kombinasyonlarının (her biri en az 20 kadın ve 10 erkek) haçlarını kurun, ancak 50 mL polipropilen beher ve üzüm agarı içeren ve kullanımdan hemen önce maya macunu ile bulaşan 6,0 cm tek kullanımlık Petri kapları kullanın. Yumurta döşeyen tabaklardaki sinekleri ihtiyaç duyulana kadar oda sıcaklığında karanlıkta tutun.
- Üzüm agar tarifi - 100 mL dondurulmuş% 100 üzüm suyu konsantresi, 350 mL deioinize su, 5 mL buzul asetik ve 13 g D. melanogaster agar'ı 1L cam bir beherde birleştirin. 1-2 dakikalık patlamalarda mikrodalga, agar tamamen çözülene kadar patlamalar arasında karıştırır. Çözeltiyi birkaç dakika soğutun, ardından% 95 etanol içine% 10 (w / v) Nipagen (metil-p-hidroksibenzoat) 10 mL ekleyin. Tek kullanımlık 6,0 cm Petri kaplarına tabak başına 7 mL pipet karıştırın, 3-4 saat oda sıcaklığında jelleşmesini ve kurumasını bekleyin. 4 °C'de plastik torbalarda saklayın.
- Maya ezmesi tarifi - 7 g kurutulmuş maya, 10 mL deiyonize su, düzgün kıvama gelene kadar bir spatula ile karıştırın.
- Deneysel ve kontrol larvaları oluşturmak için zamanlanmış yumurta koleksiyonları. Yeni, maya bulaşmış üzüm tabakları kullanarak, sabah saatlerinde karanlıkta 4 saat boyunca oda sıcaklığında yumurta toplayın. Bu 4 saat toplama plakalarını çıkarın ve yeni plakalarla değiştirin. 4 h toplama plakalarını bir gecede 25 °C'de, larvaların çoğunun yumurtadan çıktığı ertesi günün öğleden sonrasına kadar kuluçkaya yatırın. Bu ilk başlangıç larvalarını toplayın ve deneyi ayarlamak için kullanın.
2. Test plakalarının kurulması
- Test plakalarının hazırlanması. Tahlilin tek bir çalışması için, 10 deneysel larvanın her biri beş tahlil plakası ve 10 kontrol larvasının beş plakası hazırlayın. Her tabaktan bir agar çekirdeğini çıkarmak ve yiyecek için bir delik oluşturmak için 1,5 cm mantar borer kullanın. Maya macunu (0.8 - 0.9 g) deliğe koyun ve deliği dolduran bir höyük yapmak için bir spatula ile hafifçe sıvazlayın.
- Agar plaka hazırlığı - 700 mL deiyonize suyu 16 g D. melanogaster agar ile 2L cam bir beherde ve mikrodalga fırında 5 dakika birleştirin. Mikrodalga fırından çıkarın ve çözülmemiş agarı çözeltiye getirmek için cam bir çubukla karıştırın. % 95 etanolde% 10 (w / v) Nipagen'in 17,5 mL'sini ekleyin, karıştırın, ardından tüm agar tamamen çözünene kadar mikrodalga ısıtmaya 30 s'lik patlamalarda devam edin. Bir veya iki dakika soğutun, sonra pipet 15 mL aliquots içine 10 cm plastik Petri tabaklar. Agarın jelleşmesini bekleyin, tabakları kapaklarla örtün ve birkaç saat veya gece boyunca oda sıcaklığında kurumaya bırakın. Plakaları 18 °C'de kapalı plastik torbalarda saklayın.
NOT 1: Aşırı dessiccation nedeniyle plakaların yüzeyinde Nipagen kristallerinin oluşumunu önlemek için, hazırlıktan sonraki birkaç gün içinde plakaları kullanın. Gerekirse, kristaller üzerlerine birkaç mikrolitre% 95 alkol bırakarak yeniden çözülebilir.
NOT 2: agar partileri farklı jelleşme özelliklerine sahip olabilir. Kuru jel plakalar, gıda deliğini oluşturmak için mantar borerini kullanırken temiz, sağlam bir agar çemberinin çıkarabileceği dokunuşa sıkı ve yeterince dayanıklı olmalıdır (yukarıya bakın). - Test plakalarında larvaların kurulması. Plastik bir mikrospatulanın ucunu eğri hale getirmek için mekanik basınç kullanın ve larvaları toplamak için "yapıştırıcı" sağlamak için ucu maya macununa batırın. İlk başlangıç larvalarını tek tek alın ve yiyecek höyüğüne yakın agar tabağına yerleştirin. Hem deneysel hem de kontrol genotipleri için 10 larvadan en az beş çoğaltma plakası hazırlayın. Tamamlandığında, her plakayı kaplayın ve etiketleyin ve plakaları (kapak tarafı yukarı) oda sıcaklığında karanlık bir alana ayarlayın (laboratuvarımızda bu 22 °C'dir).
3. Test plakalarının izlenmesi
- Tabakları her gün bir diseksiyon mikroskobu altında inceleyin ve larva sayısını yiyeceklerin üzerine veya agar yüzeyine kaydedin. Görünür ölü veya ölmekte olan larvalara dikkat edin. Agar substratına tünel kazmanın larvaların üçüncü instar'a geçmesi olarak görüldüğünde ve varsa not edin. Pupaların oluşmaya başladığı tarihlere dikkat edin ve pupal anormallikleri not edin. Tüm larvalar ölene veya yavrulanana kadar günlük gözlemlere devam edin.
- Pupaları bükülmüş bir alay iğnesi ile plakadan dikkatlice çıkarın ve bir üzüm tabağına aktarın. İstenirse, yetişkin olarak kaç eclose olduğunu belirlemek için pupaları izlemeye devam edin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Dehydrated yeast | |||
| Frozen grape juice concentrate | Welch's | Available at most large supermarkets | |
| Glacial acetic acid | Sigma-Aldrich | 320099 | |
| Drosophila agar | Apex Bioresearch Products | 66-103 | |
| Methyl-para-hydroxybenzoate | Apex Bioresearch Products | 20-658 | |
| EQUIPMENT | |||
| 50 ml polypropylene beakers | |||
| 6.0 cm disposable Petri dishes | Falcon | 08757100B | |
| 10 cm disposable plastic Petri dishes | E+K Scientific | EK-24104 | |
| Plastic microspatulas | Corning Incorporated | 3012 | |
| Bent teasing needle | Nasco | S08848MH | |
| Dissecting microscope | Any microscope with 10-30X magnification |
