斑马鱼心电图（ECG）：评估心脏功能的最小侵入性测定

Overview

此视频展示了如何在斑马鱼身上进行心电图 （ECG 或 EKG） 测量，这是一种测量心脏电活动的测试。

Protocol

本协议摘自赵 等人， 在Vivo 表面心电图成人斑马鱼 ，J.Vis.Exp.（2019年）。

这项研究的所有实验都是根据美国国家卫生研究院《实验室动物护理和使用指南》进行的。这项研究中的所有动物协议都得到了加州大学洛杉矶分校动物护理和使用委员会的批准。

1. 麻醉感应

1. 准备浸入麻醉疼痛控制和鱼类固定，以避免在心电图数据采集期间运动神器。大多数实验室使用浸入三甲酸酯（乙基3-氨基苯甲酸酯，MS-222）。
   1. 要使三卡因 0.4% 库存溶液，将以下项目组合在螺丝盖深色玻璃瓶中：400 毫克三卡因粉末、98 毫升双蒸馏水和 2 mL 1 M 特里斯（pH 9）。根据需要使用1个N NAOH或1个N HCl调整到pH 7.0。
   2. 要使三叶草最终浸入溶液，确定适合斑马鱼年龄、大小、代谢状态、菌株、疾病模型、科学目标和程序持续时间的最低浓度。
   3. 执行三卡因浓度反应研究，如有必要，从建议浓度 168 毫克/升（或 0.0168%）⁹中向上或向下滴定，以便在 3 分钟内达到麻醉液 4 级，心肺毒性最小。例如，在这项研究中，将12-18个月大的野生AB型斑马鱼浸入0.02-0.04%的三角形溶液中，将在3分钟内诱导麻醉4级。
      注： 在麻醉的4级，平衡和肌肉张力完全丧失，手术运动率降低。
   4. 如有必要，请咨询机构动物护理和使用委员会（IACUC）的兽医，就麻醉剂的选择和施用途径的适当性提供额外指导。
2. 将成年斑马鱼浸入含有最低预定浓度和IACUC批准浓度（如本研究中的0.02-0.04%）的三甲酸溶液的盘中，在3分钟内诱导麻醉4级（图1）。
   1. 对于生存心电图协议，请保持 ECG 记录会话尽可能简短（10 分钟以下）。对于持续时间少于 15 分钟的简短心电图记录会话，无需麻醉维护。
   2. 对于持续数小时的长时间心电图记录会话，使用长效肌肉麻痹和口腔灌注系统提供充足的水化和氧合。

2. 心电图铅放置

1. 一旦斑马鱼保持4级麻醉3s，使用一对钝钳立即将鱼转移到潮湿的海绵缝上，其腹腔表面最上面放置心电图铅电极（图2）。
2. 将三个心电图铅电极轻轻插入鱼肌肉中，深度约1毫米，在前平面上建立双极引线，与心脏主轴的左腹腔右颅位平行。
3. 将正（红色）电极放置在腹腔中线的凸起动脉水平上，即在连接手术室两个下边缘的假想线上方 1-2 毫米处（图 2A）。
4. 将负（黑色）电极横向放置，0.5-1.0 mm 横向放置到正极，距离大于成年斑马鱼心室的最大腹腔长度（图 2A）。
5. 将参考（绿色）电极放在肛门区域附近。
   注： 由于心脏主轴因鱼而异，为了最大化R波和T波振幅，仅通过反复试验进行小而系统的变化来调整铅的位置。例如，一次更换一个电极（正极或负极），而不是两个电极，在更改到另一个方向之前，在一个指定方向上进行渐进更改，而不是在随机方向上做出不稳定的更改。

3. 心电图记录

1. 打开ECG数据采集计划。从下拉菜单中选择所需的设置，以获得射程、低通和高通。例如，本实验中使用的体内心电图记录系统中的以下设置为普通成年斑马鱼产生一致、令人满意的信号噪声比：范围"2 mV"、低通"120 Hz"和高通"0.03"。
2. 按 开始 以 1 kHz 的采样速率开始连续无间隙 ECG 记录。
3. 为了优化铅定位，实现最大信号噪声比，请按停止停止心电图录制，并在每个心脏的第一次记录尝试后不久查看心电图跟踪。要诊断成年斑马鱼心电图正常，请确认以下四个验证标准均符合（图3）：
   1. 标准1：确保所有心电图波形（P、QRS和T）都清晰可见。
   2. 标准2：确保P波为正。
   3. 标准3：确保净QRS复合物为正（即R波振幅大于Q和S波振幅的总和）。
   4. 标准4：确保T波为正数。
4. 如果预期有正常的心电图，请在必要时重新定位电极（先尝试负极），直到所有四个验证标准都得到满足。
5. 如果预期有正常的 T 波，但 T 波太小，则重新定位电极以最大化 T 波振幅。
6. 优化铅定位后恢复心电图记录。保存心电图扫描以供后续分析。

4. 麻醉恢复

1. 在心电图记录会话结束时，小心地取出电极，而不会伤害鱼。将鱼转移到无三角鱼的新鲜含氧鱼水中。
2. 为了便于麻醉恢复，用巴斯德移液器在刺上大力喷水，直到鱼恢复正常的刺运动或游泳。
3. 监测鱼从麻醉中完全恢复（通常为1-2分钟），如鱼直立游泳至少5秒的能力所示。

Representative Results

图1：体内心电图记录协议的微创性。 示意图流程图说明了进行心电图内部审讯的四个关键动作步骤：诱导麻醉、放置心电图铅电极、记录心电图和分析心电图记录。 请单击此处查看此图的更大版本。

图2：心电图铅放置。 三个29口径的彩色编码不锈钢电极被安全地插入鱼的肌肉中，深度约为1毫米。负（黑色）电极和正（红色）电极的放置在前平面上沿左颅向右颅方向建立双极引线。缩写：参考，参考电极。 请单击此处查看此图的更大版本。

图3：人类和斑马鱼心脏的解剖学和心电图对比。 与拥有两个腹腔和两个心室的人类心脏相比，斑马鱼的心脏只有一个中庭和一个心室（顶排）。缩写：RA，右中庭;洛杉矶，左中庭;房房，右心室：LV：左心室。斑马鱼心脏与人的心脏（下排）共享几个常见的心电图特征。 请单击此处查看此图的更大版本。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Culture dishes	Fisher Scientific	FB087571	100 mm x 20 mm
Dumont Forceps	Fine Sciense Tools	11253-20	0.1 x 0.06 mm
FE136 Animal Bio Amp	AD Instruments	FE231
Iris Forceps	Fine Sciense Tools	11064-07	0.6 x 0.5 mm
LabChart 8 Pro	AD Instruments		Software with ECG Module
Needle electrodes for Animal Bio Amp	AD Instruments	MLA1213	29 gauge
Plastic Disposable Transfer Pipets	Fisher Scientific	13-669-12	6 in., 1.2 mL
PowerLab 4/35	AD Instruments	4//35
Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate)	Sigma	E10521-10G	MS-222