Électrocardiographie du poisson zèbre (ECG) : Une analyse mini-invasive pour évaluer la fonction cardiaque

Overview

Cette vidéo montre comment effectuer des mesures d’électrocardiographie (ECG ou ECG), un test qui mesure l’activité électrique du cœur, sur un poisson zèbre.

Protocol

Ce protocole est un extrait de Zhao et coll., In Vivo Surface Electrocardiography for Adult Zebrafish, J. Vis. Exp. (2019).

Toutes les expériences de cette étude ont été menées conformément au National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals des États-Unis. Tous les protocoles animaux de cette étude ont été approuvés par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’UCLA.

1. Induction d’anesthésie

1. Préparez l’anesthésie d’immersion pour le contrôle de la douleur et l’immobilisation des poissons afin d’éviter les artefacts de mouvement lors de l’acquisition de données ECG. La plupart des laboratoires utilisent la tricaine d’immersion (méthanesulfonate éthylique 3-aminobenzoate, MS-222).
   1. Pour faire la solution de stock de tricaine 0.4%, combinez les articles suivants dans une bouteille en verre foncé vissée : 400 mg de poudre de tricaine, 98 mL d’eau distillée double, et 2 mL de 1 M Tris (pH 9). Réglez au pH 7.0 en utilisant 1 N NaOH ou 1 N HCl au besoin.
   2. Pour faire la solution finale d’immersion de tricaine, déterminez la concentration minimale qui convient à l’âge, à la taille, à l’état métabolique, à la souche, au modèle de maladie, aux objectifs scientifiques et à la durée procédurale du poisson zèbre.
   3. Effectuer une étude de concentration-réponse de tricaine, titrant vers le haut ou vers le bas de la concentration recommandée de 168 mg/L (ou 0.0168%)⁹si nécessaire, pour atteindre le niveau 4 de l’anesthésie dans un délai de 3 min avec le moins de toxicités cardiorespiratoires possibles. Par exemple, dans cette étude, l’immersion du poisson zèbre AB de type sauvage de 12-18 mois dans une solution tricaine de 0,02 à 0,04 % induirea le niveau 4 de l’anesthésie dans les 3 minutes.
      REMARQUE: Au niveau 4 de l’anesthésie, l’équilibre et le tonus musculaire sont complètement perdus et le taux de mouvement operculaire est réduit.
   4. Au besoin, consultez le vétérinaire du Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) pour obtenir des conseils supplémentaires sur la pertinence de la sélection des anesthésiques et des itinéraires d’administration.
2. Immerger un poisson zèbre adulte dans un plat contenant la solution tricaine de la concentration prédéterminée et approuvée par l’IACUC (p. ex., 0,02 à 0,04 % dans cette étude) pour induire le niveau 4 de l’anesthésie dans les 3 minutes(figure 1).
   1. Pour survivre protocole ECG, garder la session d’enregistrement ECG aussi brève que possible (moins de 10 min). Pour les brèves sessions d’enregistrement ECG de moins de 15 minutes, l’entretien de l’anesthésie n’est pas nécessaire.
   2. Pour de longues sessions d’enregistrement ECG d’une durée d’heures, utilisez un paralytique intramusculaire à action prolongée et un système de perfusion orale pour fournir une hydratation et une oxygénation suffisantes.

2. Placement de plomb ECG

1. Une fois que le poisson zèbre maintient le niveau 4 de l’anesthésie pendant 3 s, utilisez une paire de forceps contondants pour transférer le poisson immédiatement sur la fente humide de l’éponge avec sa surface ventrale supérieure pour le placement des électrodes de plomb ECG (Figure 2).
2. Insérez doucement les trois électrodes de plomb ECG dans la musculature du poisson à environ 1 mm de profondeur pour établir un plomb bipolaire dans le plan frontal qui fait le parallèle avec l’orientation crânienne caudale-droite gauche de l’axe principal cardiaque.
3. Placez l’électrode positive (rouge) dans la ligne médiane ventrale au niveau de l’artériosus bulbus, c’est-à-dire à 1-2 mm au-dessus d’une ligne imaginaire reliant les deux bords inférieurs de l’operculum (Figure 2A).
4. Placez l’électrode négative (noire) caudally et 0,5-1,0 mm laissé latéralement à l’électrode positive, à une distance supérieure à la longueur apicobasale maximale du ventricule adulte de poisson zèbre (figure 2A).
5. Positionner l’électrode de référence (verte) caudally, près de la région aale.
   REMARQUE: Étant donné que l’axe principal cardiaque varie quelque peu d’un poisson à l’autre, afin de maximiser les amplitudes des ondes R et T, ajustez les positions de plomb en n’effectuant que de petits changements systématiques par essais et erreurs. Par exemple, changer une électrode (positive ou négative), au lieu des deux électrodes, à la fois et faire des changements graduels dans une direction spécifiée avant de passer à une autre direction au lieu d’apporter des changements erratiques dans des directions aléatoires.

3. Enregistrement ECG

1. Ouvrez le programme d’acquisition de données ECG. Sélectionnez un paramètre désiré parmi les menus de drop-down pour la gamme, le pass bas et le pass élevé. Par exemple, le réglage suivant dans le système d’enregistrement ECG in vivo utilisé dans cette expérience donne un rapport signal-bruit cohérent et satisfaisant pour un poisson zèbre adulte normal : plage « 2 mV », passage bas « 120 Hz » et passage élevé « 0,03 s ».
2. Appuyez sur Commencez à commencer l’enregistrement continu sans écart ecg à un taux d’échantillonnage de 1 kHz.
3. Pour optimiser le positionnement du plomb pour un rapport signal-bruit maximal, appuyez sur Arrêt pour arrêter l’enregistrement ECG et examiner la trace ECG peu après la toute première tentative d’enregistrement pour chaque cœur. Pour diagnostiquer qu’un ECG adulte de poisson zèbre est normal, confirmez que les quatre critères de validation suivants sont satisfaits (figure 3) :
   1. Critère 1 : S’assurer que toutes les formes d’ondes ECG (P, QRS et T) sont distinctes et facilement visibles.
   2. Critère 2 : S’assurer que la vague P est positive.
   3. Critère 3 : S’assurer que le complexe QRS net est positif (c.-à-d. que l’amplitude des ondes R est supérieure à la somme des amplitudes d’ondes Q et S).
   4. Critère 4 : Assurez-vous que la vague T est positive.
4. Si un ECG normal est attendu, repositionnez les électrodes (essayez d’abord l’électrode négative) si nécessaire, jusqu’à ce que les quatre critères de validation soient satisfaits.
5. Si une onde T normale est attendue, mais que l’onde T est trop petite, repositionnez les électrodes pour maximiser l’amplitude des ondes T.
6. Reprendre l’enregistrement ECG après avoir optimiser le positionnement du plomb. Enregistrez les balayages ECG pour une analyse ultérieure.

4. Récupération de l’anesthésie

1. À la fin de la séance d’enregistrement de l’ECG, retirer soigneusement les électrodes sans blesser le poisson. Transférer le poisson dans de l’eau de poisson fraîche et oxygénée exempte de tricaine.
2. Pour faciliter le rétablissement de l’anesthésie, gicler vigoureusement l’eau sur les branchies à l’aide d’une pipette Pasteur jusqu’à ce que le poisson reprenne le mouvement régulier des branchies ou la baignade.
3. Surveillez le poisson pour une récupération complète de l’anesthésie (généralement 1-2 min), comme indiqué par la capacité du poisson à nager debout pendant au moins 5 s.

Representative Results

Figure 1 : Protocole d’enregistrement in vivo ECG mini-invasif. Un diagramme schématique d’écoulement illustre quatre étapes critiques d’action en menant un interrogatoire in vivo d’ECG : induire l’anesthésie, placer des électrodes de plomb d’ECG, enregistrer ECG, et analyser les enregistrements d’ECG. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2 : Placement de plomb ECG. Trois électrodes en acier inoxydable codées en couleur de calibre 29 sont insérées solidement dans la musculature du poisson à environ 1 mm de profondeur. Le placement de l’électrode négative (noire) et de l’électrode positive (rouge) établit un plomb bipolaire dans le plan frontal, le long d’une orientation crânienne caudale gauche à droite. Abréviation : réf, électrode de référence. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3 : Anatomie contrastante et ECG des coeurs humains et de poisson zèbre. Contrairement au cœur humain avec deux oreillettes et deux ventricules, le cœur de poisson zèbre n’a qu’un atrium et un ventricule (rangée supérieure). Abréviations: RA, atrium droit; La, atrium gauche; RV, ventricule droit; LV: ventricule gauche. Le cœur de poisson zèbre partage plusieurs caractéristiques ecg communes avec le cœur humain (rangée inférieure). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Culture dishes	Fisher Scientific	FB087571	100 mm x 20 mm
Dumont Forceps	Fine Sciense Tools	11253-20	0.1 x 0.06 mm
FE136 Animal Bio Amp	AD Instruments	FE231
Iris Forceps	Fine Sciense Tools	11064-07	0.6 x 0.5 mm
LabChart 8 Pro	AD Instruments		Software with ECG Module
Needle electrodes for Animal Bio Amp	AD Instruments	MLA1213	29 gauge
Plastic Disposable Transfer Pipets	Fisher Scientific	13-669-12	6 in., 1.2 mL
PowerLab 4/35	AD Instruments	4//35
Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate)	Sigma	E10521-10G	MS-222