Electrocardiografía de pez cebra (ECG): un ensayo mínimamente invasivo para evaluar la función cardíaca

Overview

Este vídeo muestra cómo realizar mediciones de electrocardiografía (ECG o ELECTROKG), una prueba que mide la actividad eléctrica del corazón, en un pez cebra.

Protocol

Este protocolo es un extracto de Zhao et al, Electrocardiografía de superficie in vivo para peces cebra adultos, J. Vis. Exp. (2019).

Todos los experimentos de este estudio se llevaron a cabo de acuerdo con la Guía de Los Institutos Nacionales de Salud de los Estados Unidos para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. Todos los protocolos de animales en este estudio fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de UCLA.

1. Inducción por anestesia

1. Prepare anestesia de inmersión para el control del dolor y la inmovilización de peces para evitar artefactos de movimiento durante la adquisición de datos de ECG. La mayoría de los laboratorios utilizan tricarina de inmersión (etílico 3-aminobenzoato metanoesulfonato, MS-222).
   1. Para hacer la solución de caldo de tricaina 0.4%, combine los siguientes artículos en una botella de vidrio oscuro tapada atornillada: 400 mg de polvo de tricarina, 98 ml de agua destilada doble y 2 ml de tris de 1 M (pH 9). Ajuste al pH 7.0 usando 1 N NaOH o 1 N HCl según sea necesario.
   2. Para hacer la solución de inmersión final de la tricarina, determinar la concentración mínima adecuada para la edad del pez cebra, tamaño, estado metabólico, cepa, modelo de enfermedad, objetivos científicos y duración procesal.
   3. Realizar un estudio de concentración-respuesta a la tricarina, valorando hacia arriba o hacia abajo desde la concentración recomendada de 168 mg/L (o 0,0168%)⁹si es necesario, para alcanzar el nivel 4 de anestesia en 3 minutos con el menor número posible de toxicidades cardiorrespiratorias. Por ejemplo, en este estudio, la inmersión de pez cebra AB de tipo salvaje de 12-18 meses de edad en una solución de tricarina de 0,02-0,04% inducirá el nivel 4 de anestesia en un plazo de 3 minutos.
      NOTA: En el nivel 4 de anestesia, el equilibrio y el tono muscular se pierden por completo y se reduce la tasa de movimiento opercular.
   4. Si es necesario, consulte al veterinario en el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) para obtener orientación adicional sobre la idoneidad de la selección de anestésicos y la vía de administración.
2. Sumerja un pez cebra adulto en un plato que contenga solución de tricarina de la concentración predeterminada más baja y aprobada por el IACUC (por ejemplo, 0,02-0,04% en este estudio) para inducir el nivel 4 de anestesia en un plazo de 3 min(Figura 1).
   1. Para el protocolo ECG de supervivencia, mantenga la sesión de grabación del ECG lo más breve posible (menos de 10 min). Para sesiones breves de grabación de ECG de menos de 15 minutos, no es necesario el mantenimiento de la anestesia.
   2. Para largas sesiones de grabación de ECG que duren horas, utilice un paralítico intramuscular de acción prolongada y un sistema de perfusión oral para proporcionar una amplia hidratación y oxigenación.

2. Colocación de plomo ecg

1. Una vez que el pez cebra mantenga el nivel 4 de anestesia durante 3 s, utilice un par de fórceps contundentes para transferir los peces inmediatamente a la hendidura de esponja húmeda con su superficie ventral más alta para la colocación de electrodos de plomo ECG(Figura 2).
2. Inserte suavemente los tres electrodos de plomo ECG en la musculatura del pez a aproximadamente 1 mm de profundidad para establecer un plomo bipolar en el plano frontal que sea paralelo a la orientación craneal caudal-derecha izquierda del eje principal cardíaco.
3. Coloque el electrodo positivo (rojo) en la línea media ventral a nivel del bulbo arterioso, es decir, a 1-2 mm por encima de una línea imaginaria que conecte los dos bordes inferiores de los operculums(Figura 2A).
4. Coloque el electrodo negativo (negro) caudalmente y 0,5-1,0 mm a la izquierda lateralmente en el electrodo positivo, a una distancia mayor que la longitud máxima del ventrículo adulto de pez cebra(Figura 2A).
5. Coloque el electrodo de referencia (verde) caudalmente, cerca de la región anal.
   NOTA: Dado que el eje principal cardíaco varía un poco de peces a peces, para maximizar las amplitudes de ondas R y T, ajuste las posiciones de plomo haciendo sólo pequeños cambios sistemáticos a través del ensayo y el error. Por ejemplo, cambie un electrodo (positivo o negativo), en lugar de ambos electrodos, a la vez y realice cambios graduales en una dirección especificada antes de cambiar a otra dirección en lugar de realizar cambios erráticos en direcciones aleatorias.

3. Grabación de ECG

1. Abra el programa de adquisición de datos de ECG. Seleccione la configuración deseada en los menús desplegables para el rango, el paso bajo y el paso alto. Por ejemplo, la siguiente configuración en el sistema de grabación de ECG in vivo utilizado en este experimento produce una relación señal-ruido consistente y satisfactoria para un pez cebra adulto normal: rango "2 mV", paso bajo "120 Hz" y paso alto "0,03 s".
2. Pulse Inicio para iniciar la grabación ecg sin brechas continuas a una velocidad de muestreo de 1 kHz.
3. Para optimizar el posicionamiento del cable para la relación señal-ruido máxima, pulse Detener para detener la grabación de ECG y revise la traza de ECG poco después del primer intento de grabación para cada corazón. Para diagnosticar que un ECG adulto de pez cebra es normal, confirme que se cumplen los cuatro criterios de validación siguientes (Figura 3):
   1. Criterio 1: Asegúrese de que todas las formas de onda de ECG (P, QRS y T) sean distintas y fácilmente visibles.
   2. Criterio 2: Asegúrese de que la onda P sea positiva.
   3. Criterio 3: Asegúrese de que el complejo QRS neto sea positivo (es decir, la amplitud de la onda R es mayor que la suma de las amplitudes de onda Q y S).
   4. Criterio 4: Asegúrese de que la onda T sea positiva.
4. Si se espera un ECG normal, vuelva a colocar los electrodos (pruebe primero el electrodo negativo) si es necesario, hasta que se cumplan los cuatro criterios de validación.
5. Si se espera una onda T normal, pero la onda T es demasiado pequeña, vuelva a colocar los electrodos para maximizar la amplitud de la onda T.
6. Reanudar la grabación de ECG después de optimizar el posicionamiento del cable. Guarde los barridos de ECG para su análisis posterior.

4. Recuperación de la anestesia

1. Al final de la sesión de grabación del ECG, retire cuidadosamente los electrodos sin herir a los peces. Transfiera el pescado a agua de pescado fresca y oxigenada libre de tricaina.
2. Para facilitar la recuperación de la anestesia, chorree agua sobre las branquias vigorosamente con una pipeta Pasteur hasta que el pez reanude el movimiento regular de las branquias o la natación.
3. Monitoree los peces para la recuperación completa de la anestesia (típicamente 1-2 min), como lo indica la capacidad de los peces para nadar erguido durante al menos 5 s.

Representative Results

Figura 1: Protocolo de grabación ecg in vivo mínimamente invasivo. Un diagrama de flujo esquemático ilustra cuatro pasos de acción críticos en la realización de un interrogatorio de ECG in vivo: inducir anestesia, colocar electrodos de plomo ECG, grabar ECG y analizar las grabaciones de ECG. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Colocación de clientes potenciales ecg. Tres electrodos de acero inoxidable codificados por colores del calibre 29 se insertan de forma segura en la musculatura de los peces a aproximadamente 1 mm de profundidad. La colocación del electrodo negativo (negro) y el electrodo positivo (rojo) establece un plomo bipolar en el plano frontal, a lo largo de una orientación craneal caudal izquierda a derecha. Abreviatura: ref, electrodo de referencia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Anatomía contrastante y ECG de corazones humanos y de pez cebra. A diferencia del corazón humano con dos atrias y dos ventrículos, el corazón de pez cebra tiene sólo un atrio y un ventrículo (fila superior). Abreviaturas: AR, atrio derecho; Los Ángeles, atrio izquierdo; RV, ventrículo derecho; LV: ventrículo izquierdo. El corazón del pez cebra comparte varias características comunes de ECG con el corazón humano (fila inferior). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Culture dishes	Fisher Scientific	FB087571	100 mm x 20 mm
Dumont Forceps	Fine Sciense Tools	11253-20	0.1 x 0.06 mm
FE136 Animal Bio Amp	AD Instruments	FE231
Iris Forceps	Fine Sciense Tools	11064-07	0.6 x 0.5 mm
LabChart 8 Pro	AD Instruments		Software with ECG Module
Needle electrodes for Animal Bio Amp	AD Instruments	MLA1213	29 gauge
Plastic Disposable Transfer Pipets	Fisher Scientific	13-669-12	6 in., 1.2 mL
PowerLab 4/35	AD Instruments	4//35
Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate)	Sigma	E10521-10G	MS-222