Summary
Aquí se utiliza una biblioteca esiRNA humanos en una pantalla de alto rendimiento de los genes implicados en la división celular. Demostramos cómo configurar y llevar a cabo una esiRNA pantallas, así como la forma de analizar y validar los resultados.
Abstract
ARN de interferencia (ARNi) es un mecanismo celular básico para el control de la expresión génica. El ARNi es inducida por el corto ARN de doble cadena también conocido como pequeños RNAs de interferencia (siRNA). El corto ARN de doble cadena se originan a partir de precursores más de doble cadena por la actividad de Dicer, una proteína de la familia de RNasa III de endonucleasas. Los fragmentos resultantes son los componentes del complejo de ARN inducida por silenciar (RISC), dirigiendo a la meta del mRNA afines. RISC corta el ARNm diana lo que se reduce la expresión de la proteína codificada 1,2,3. RNAi se ha convertido en un método experimental poderosa y ampliamente utilizado para la pérdida de los estudios de la función de genes en células de mamíferos que utilizan pequeños RNAs de interferencia.
Actualmente hay dos métodos principales se encuentran disponibles para la producción de pequeños RNAs de interferencia. Un método consiste en la síntesis química, mientras que un método alternativo emplea endonucleolytic división del objetivo específico a largo ARN de doble cadena de RNasa III in vitro. Por lo tanto, un grupo diverso de como siRNA oligonucleótidos se produce lo que se conoce también como endoribonuclease preparado siRNA o esiRNA. Una comparación de la eficacia de siRNAs químicamente derivados y esiRNAs muestra que los dos gatillos son potentes en el silenciamiento de genes diana. Las diferencias pueden, sin embargo, se observa al comparar la especificidad. Muchos siRNAs única de síntesis química produce importantes efectos fuera del objetivo, mientras que la mezcla compleja inherente a esiRNAs conduce a una caída más específico 10.
En este estudio, se presenta el diseño de bibliotecas a escala del genoma esiRNA MISIÓN y su utilización para la investigación de RNAi ejemplificado por una pantalla de contenido de ADN para la identificación de genes implicados en la progresión del ciclo celular. Mostramos la manera de optimizar el protocolo de transfección y el ensayo para la detección de alto rendimiento. También muestra cómo grandes grupos de datos pueden ser evaluados estadísticamente y los actuales métodos para validar accesos principales. Por último, damos los posibles puntos de partida para nuevas caracterizaciones funcionales de accesos validado.
Protocol
1. De alta calidad bibliotecas MISIÓN esiRNA
- Para cada gen de interés de la región de destino más sensibles y específicos para la utilización de ARNi se elige el algoritmo DEQOR (http://cluster-1.mpi-cbg.de/Deqor/deqor.html). 4 puntuaciones DEQOR el potencial de silenciamiento de todos los posible 21 nucleótidos de largo siRNAs en un objetivo-mRNA basado en el estado de la técnica de diseño 4-restricciones. Además, cada siRNA potenciales se analizan las posibles reacciones cruzadas con otros genes mediante la realización de una búsqueda BLAST contra el transcriptoma del organismo estudiado. Modo, el programa proporciona un análisis de la calidad y el silenciamiento de las capacidades transversales de la esiRNA potencial (300-600 pb de longitud).
- La zona elegida de la meta-gen de ADNc se amplificó por PCR utilizando cebadores específicos del gen flanqueado por bacteriófagos ARN-polimerasa-promotor de las secuencias.
- Cada producto de PCR utilizado para la producción MISIÓN esiRNA se verifica la identidad de la secuenciación y análisis de pureza Caliper LabChip.
- Largo ARN de doble cadena se transcribe a partir del producto de PCR por la ARN polimerasa, seguida de una hibridación de las cadenas transcritas.
- esiRNAs son preparados por la digestión enzimática limitada de la larga ARN de doble cadena utilizando RNaseIII seguido por la purificación mediante cromatografía de intercambio aniónico utilizando Q-sefarosa columnas de centrifugado.
- esiRNAs se precipitan y resuspendido en buffer TE. El rendimiento se mide por las mediciones de la absorción de los rayos UV y la concentración se ajusta mediante la disolución en un volumen adecuado de tampón TE. La calidad general del producto final está marcada por Caliper análisis LabChip.
2. La elección de una línea celular y la optimización de transfección para la detección
- Cantidades titular de esiRNA (uso Eg5 como positivo y renilla-luciferasa como control negativo) y el aumento de las cantidades de reactivo de transfección en una placa de 384 pocillos, agregar las células y se incuba durante 48 horas. Eg5 es una proteína motora quinesina necesarias para el montaje del huso bipolar y el agotamiento conduce a un arresto mitótico. Repita este procedimiento para los reactivos de transfección diferentes líneas celulares. Aquí, nosotros usamos las células HeLa cultivadas siguiendo los procedimientos estándar y oligofectamine (Invitrogen) como reactivo de transfección.
- Para la elección de las condiciones óptimas de transfección contar las células transfectadas con Eg5 esiRNAs que muestran un paro mitótico (forma redonda) y el número total de células transfectadas con renilla-luciferasa (Rluc) esiRNA por microscopía de luz. Elija el estado con la menor toxicidad para Rluc y el fenotipo más pronunciado para Eg5.
Un método alternativo para optimizar las condiciones de transfección consiste en una línea celular estable que expresan EGFP (u otro gen reportero adecuado), bajo el control de un promotor activo constitutiva. Después de la transfección de un esiRNA contra EGFP (u otro gen reportero) y Rluc (u otro esiRNA adecuado control negativo) medida derribo eficacia y la toxicidad por ejemplo, la clasificación de fluorescencia de células asistida (FACS). Asegúrese de que el esiRNA utilizado para EGFP es totalmente complementaria con el objetivo de ARNm.
3. Configuración de la pantalla principal 5,6
- Optimizar la precisión de pipeteo para todos los componentes utilizados en una estación de pipeteo automatizado (por ejemplo, Acuario, Tecan y WellMate, Matrix). Debido a que los parámetros de pipeteo cambiar en función del tipo de tipo de solución, el volumen y la placa de esta optimización tiene que ser repetido para cada etapa por separado. Si es posible, la estación de pipeteo debe ser colocado bajo una campana de flujo laminar para evitar la contaminación. Todos los componentes utilizados deben ser desinfectados antes de su uso ya sea en autoclave o en su caso por pulverización con etanol al 75%. Optimizar los protocolos de lavado de modo que la contaminación cruzada de pozo a pozo está excluida. Detalles para la optimización de pipeteo automático no se puede dar el espacio para las restricciones y dependen en gran medida de la estación de pipeteo utilizadas. Para más información consulte a los fabricantes de protocolo.
- Transfectar células en formato de 384 pocillos con las condiciones optimizadas desde arriba con esiRNAs para Eg5 y Rluc. Use un patrón alternante de Eg5 y esiRNA Rluc cubriendo todo el plato.
- Después de la incubación durante 48 horas, fijar las células con etanol frío al 100%, rehidratar en PBS durante 15 minutos, la mancha durante 25 minutos en PBS que contenía 1 mg / ml DAPI y 100 ug / ml RNasa A (Qiagen). Por último lavado con PBS y se almacenan a 4 ° C.
- Medir la intensidad de fluorescencia DAPI-por ejemplo, la microscopía en un sistema Olympus ScanR. Generar un histograma mediante el trazado de la intensidad de DAPI contra el número de células y evaluar la distribución del ciclo celular mediante el cálculo del porcentaje de células con el 2N contenido de ADN para la fase G1; <2N> 4N de la fase S; 4N para G2/M-phase y > 4N de aneuploidía / poliploidía.
- Evaluar la homogeneidad de los resultados sobre la placa. Una mayor optimización es necesaria si los resultados difieren significativamente de excluir a effe posicióncts. Un problema común cuando se utilizan múltiples placas es aumento de la evaporación en los pozos del borde durante el tiempo de incubación. Esto lleva a diferentes condiciones experimentales en diferentes pozos, que a menudo se traduce en efectos específicos de posición de la placa. Por esta razón, se recomienda dejar todos los pozos vacíos borde de una pantalla. Para minimizar aún más la evaporación asegurarse de que las incubadoras se mantienen a la alta humedad. También emplean habitualmente las barreras evaporación, tales como cintas de sellado Corning transpirable que bloquean la evaporación. Recursos también para otros efectos de posición tienen que ser tomadas en cuenta, por ejemplo, la variación técnica del sistema de lectura (microscopio, lector de placas, etc) o las variaciones en el manejo de líquidos (pendientes, falta de homogeneidad de las soluciones, etc.)
- Las diferencias estadísticas entre los controles positivos y negativos de proporcionar una medida de la importancia de los análisis utilizados. Una gran diferencia entre el control negativo (o el ruido de fondo, la maqueta de control) y la muestra tiene que ser establecida antes de iniciar el examen real. Una buena medida para la significación estadística es el factor Z. El factor Z se calcula con la ecuación:
Z = 1 - (3 SD [muestra] + 3 SD [maqueta]) * (| Av. [muestra] - Av. [maqueta] |) -1; con SD: desviación estándar; Av: media. Un factor Z de 1> Z> 0,5 indica una separación significativa de los controles negativos (y ruido) de los controles positivos 7.
4. Pantalla principal
- Preparar 384 y placas de cultivo de tejidos para la transfección de esiRNAs utilizando las condiciones optimizadas desde arriba. Aquí, nosotros usamos esiRNA 15NG por bien disuelta en buffer TE 5μl. Al menos ocho puestos de control por placa se debe cargar con adecuados controles positivos y negativos de los procesos biológicos estudiados (en este caso Eg5 y Rluc). Para evitar los efectos de posición de los pozos se cargan con borde 5μl buffer TE solamente.
- Añadir 5μl OptiMEM (Invitrogen) que contiene Oligofectamine 0.2μl por tanto, mezclar e incubar durante 20 minutos a temperatura ambiente.
- Añadir la suspensión de células en la mezcla de transfección (aquí: 40μl de una suspensión de células HeLa a 25 células / l de concentración, equivalente a 1.000 células por pocillo) y se incuba durante 72 horas.
- Medida del ADN contenido en un microscopio automatizado (Olympus ScanR, ver arriba). Evaluar con Z-score estadísticas para la selección de golpe: Z-scores se calculan para todos los esiRNAs muestra usando la señal para el control negativo como referencia. Tenga en cuenta que el Z-score no es el mismo que el Z-factor. Z-scores proporcionar una medida estadística de significación de los valores de la muestra, en comparación con un control (maqueta). Se calcula según la ecuación:
Z = (valor [Sample] - media [maqueta]) * desviación estándar [maqueta] -1.
Para la selección de un umbral de éxito tiene que ser aplicado. Por lo general, un criterio de importancia como: 2 <Z <-2 se utiliza, pero dependiendo de la calidad del conjunto de datos, el proceso biológico estudiado o, simplemente, el alcance de la pantalla, los umbrales aplicables sean diferentes. Junto a la relativamente fácil puntaje Z-estadísticas métodos matemáticos también más elaborado de evaluación se pueden utilizar (en su interior por primera vez en el amplio campo de la evaluación estadística de los datos de investigación se puede encontrar en el Malo et al. 8).
5. Pantalla secundaria y la validación de éxito
- Una pantalla secundaria sigue la pantalla principal para eliminar falsos positivos debido a errores experimentales o efectos fuera del objetivo. Por los golpes seleccionado el mismo procedimiento que el utilizado en la pantalla principal se debe repetir para un mayor número de repeticiones (3-5) para permitir una mejor evaluación estadística.
- Por éxitos verificado una esiRNA secundaria que no se superponen (o cualquier otro disparo silenciador no se superponen) con los objetivos fijados en las pantallas iniciales deben ser utilizados. El mismo ensayo y lectura se debe aplicar en cuanto a la pantalla principal.
- En última instancia los genes seleccionados pueden ser validadas por las especies cruzadas de rescate RNAi 9. Por lo tanto un cromosoma artificial bacteriano (BAC) que codifica por ejemplo, el ortólogo de ratón de los genes es transfectadas establemente en las células. BAC-construcciones de preservar un gen en su contexto genómico y permitir una expresión casi fisiológica. ARNi contra el gen humano endógeno saldrá de la expresión transgénica de ratón alterado que rescata la RNAi fenotipo. RNAi de rescate proporciona el estándar de oro para la verificación de los fenotipos RNAi disponible hasta la fecha.
- Finalmente, los candidatos validados se estudian con más detalle a la larga se derivan comprensión mecanicista. En muchos casos, el ARNi puede ser utilizado en estos experimentos, por ejemplo, en los ensayos de secundaria, más elaborado.
Discussion
La interferencia de ARN se ha convertido en una técnica estándar para estudiar la pérdida de la función de los fenotipos. A gran escala colecciones de RNAi mediadores están disponibles a partir de diferentes proveedores y proporcionar un método fácil, rentable y rápida para la silenciación del gen. Esto abrió la puerta para la detección sistemática de agentes clave en muchos procesos biológicos que permite un punto de vista del genoma a gran escala sobre una amplia gama de diferentes especies y tipos de células.
Las altas tasas de falsos positivos y falsos negativos es un reto común en las pantallas de RNAi. Para solucionar este problema, han realizado considerables esfuerzos invertidos para mejorar la eficacia y, en particular, provoca la especificidad de la silenciación. Un descubrimiento importante fue que un grupo de diferentes siRNAs dirigidos la misma transcripción mejora en gran medida la especificidad de destino. Debido a que un grupo muy complejo de diferentes siRNAs se produce por la endoribonuclease, esiRNAs son de alta especificidad desencadena objetivo, la reducción de la tasa de falsos positivos en las pantallas de RNAi. esiRNAs también han demostrado para lograr caídas eficaz, reduciendo también la tasa de falsos negativos.
Como las pantallas de RNAi son técnicamente exigentes, probablemente seguirá siendo un reto para llevar a cabo de forma rutinaria durante algún tiempo. Sin embargo, como los reactivos y los instrumentos de los laboratorios de obtener una mejor y más compartir su experiencia, el uso de pantallas de RNAi en la biología moderna se considera que aumentará en el futuro.
Disclosures
Autores declaran las relaciones financieras con entidades comerciales que puedan tener un interés en el trabajo presentado.
Acknowledgments
Queremos agradecer a los miembros del laboratorio Buchholz y el Sigma-Aldrich RNAi de equipo para la discusión. Nos gustaría agradecer a la Sociedad Max Planck y el Bundesministerium für Bildung und Forschung Grandes Go-Bio [0315105] para la ayuda.
MISIÓN ® es una marca registrada de Sigma-Aldrich Biotecnología LP
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MISSION esiRNA | Sigma-Aldrich | For additional information contact: rnai@sial.com | |
| Wellmate | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| Breathable sealing tape | Corning | Breathable Sealing Tape, Sterile (Product #3345) | |
| OptiMEM | Invitrogen | ||
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | 200 proof (absolute), for molecular biology |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P5493 | BioReagent, 10x concentrate, suitable for cell culture, for molecular biology |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Sigma-Aldrich | D8417 | Poweder, BioReagent, suitable for cell culture, >98% (HPLC and TLC) |
| Ribonuclease A from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | R6513 | For molecular biology, ≥70 Kunitz units/mg protein, lyophilized powder |
| Tris-EDTA buffer solution | Sigma-Aldrich | T9285 | 100 x, for molecular biology |
References
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- Jackson, A. L. Expression profiling reveals off-target gene regulation by RNAi. Nat Biotechnol. 21, 635-637 (2003).
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