Summary
여기 우리는 세포 분열에 관련된 유전자에 대한 높은 처리량 화면에 인간의 esiRNA 라이브러리를 사용합니다. 우리는 설정하고 esiRNA 화면뿐만 아니라, 어떻게 결과를 분석하고 검증을 실시하는 방법을 보여줍니다.
Abstract
RNA 간섭 (RNAi)는 유전자 발현의 제어를위한 기본적인 세포 메커니즘입니다. RNAi는 작은 방해 RNAS (siRNAs)로 알려진 짧은 두 번 좌초 RNAS에 의해 유발됩니다. 짧은 이중 좌초 RNAS은 주사위 놀이를하는 사람, endonucleases의 RNase III 제품군의 단백질의 활동에 의해 더 이상 두 번 좌초 엽 성의 전구 물질에서 발생한. 결과 조각은 동족의 목표 mRNA에 지시, RNA 유도 입을 복합 (RISC)의 구성 요소입니다. RISC는이를 인코딩 단백질 1,2,3의 표현을 줄이는 목표 mRNA를 클리브스. RNAi는 작은 간섭 RNAS을 이용한 포유 동물 세포에서 유전자 기능 연구의 손실에 대한 강력하고 널리 사용되는 실험 방법이되었다.
현재 두 가지 방법은 작은 간섭 RNAS의 생산에 사용할 수 있습니다. 다른 방법은 체외에서 RNase III에 의해 대상 특정 긴 이중 좌초 RNAS의 endonucleolytic 절단을 고용하고 반면에 한 가지 방법은, 화학 합성을 포함한다. 따라서, siRNA와 같은 oligonucleotides의 다양한 수영장도 endoribonuclease - 준비 siRNA 또는 esiRNA로 알려져있는 생산됩니다. 화학적 파생 siRNAs와 esiRNAs의 효능의 비교 모두 트리거 대상 - 유전자 입을에 관심이있다는 것을 보여줍니다. 특이성을 비교할 때 차이는, 그러나, 볼 수 있습니다. esiRNAs 고유의 복잡한 혼합물이보다 구체적인 최저 10 리드 반면, 대부분 하나의 화학적 합성 siRNAs는 유명한 오프 대상 효과를 생산하고 있습니다.
본 연구에서는, 우리는 게놈 규모 선교 esiRNA 라이브러리와 세포주기의 진행에 관련된 유전자의 식별을위한 DNA - 컨텐츠 화면에 exemplified RNAi 심사에 대한 활용의 디자인을 제시한다. 우리는 transfection 프로토콜 및 높은 처리량의 심사에 대한 분석을 최적화하는 방법을 보여줍니다. 우리는 또한 통계적으로 평가할 수있는 방법을 대규모 데이터 세트 설명하고 기본 공격을 확인하는 방법을 제시한다. 마지막으로, 우리는 검증된 히트 자세한 기능 characterizations에 대한 잠재적인 시작 포인트를 제공합니다.
Protocol
1. 고품질 선교 esiRNA 라이브러리
- 관심있는 모든 유전자에 대한 RNAi에 가장 취약하고 구체적인 대상 지역은 DEQOR 알고리즘 (http://cluster-1.mpi-cbg.de/Deqor/deqor.html)를 활용하여 선택됩니다. 4 DEQOR 점수 모두의 입을 가능성을 대상 - mRNA 가능 21 세포핵 긴 siRNAs는 국가 수준의 예술 설계 제약 조건을 기반으로 4. 또한, 각각의 잠재적인 siRNA는 공부 유기체의 transcriptome에 대한 BLAST 검색을 수행하여 다른 유전자 가능한 교차 반응에 대한 분석입니다. 이 프로그램은이를 통해 전반적인 품질과 잠재적인 esiRNA (300-600 BP의 길이)의 교차 입을 용량의 분석 서비스를 제공합니다.
- cDNA 대상 - 유전자의 선택한 지역은 박테리오 파지 RNA - 효소 - 발기인 시퀀스 둘러싸인 유전자 특정 primers를 사용하여 PCR로 증폭됩니다.
- 선교 esiRNA 생산에 사용되는 모든 PCR 제품은 칼리퍼 Labchip 분석하여 시퀀싱의 정체성과 순도에 대해 확인됩니다.
- 롱 더블 좌초 RNA는 베꼈는데 가닥 어닐링 다음 RNA의 효소에 의해 PCR - 제품에서 베꼈는데 있습니다.
- esiRNAs는 Q - 세파 로스의 스핀 컬럼을 이용한 음이온 교환 크로마 토그래피를 통해 정화 다음 RNaseIII를 사용하여 긴 이중 좌초 RNA의 제한 효소 소화에 의해 준비가되어 있습니다.
- esiRNAs는 시켰던 및 TE 버퍼에 resuspended 있습니다. 수율은 UV - 흡수 측정에 의해 측정하고 농도는 TE 버퍼의 적절한 볼륨의 용해에 의해 조정됩니다. 최종 제품의 전반적인 품질은 칼리퍼 Labchip 분석에 의해 확인됩니다.
2. 세포 라인을 선택하고 검사 transfection 최적화
- esiRNA (긍정적이고 부정적인 제어로 renilla - 루시페라제로 사용 Eg5)와 384 잘 플레이트의 transfection 시약의 양을 증가의 적정하다 금액이 48 시간 동안 세포와 부화를 추가합니다. Eg5는 바이폴라 스핀들 조립 및 고갈에 필요한 kinesin 모터 단백질 것은 mitotic의 체포로 연결됩니다. 다른 transfection의 시약 및 세포 라인에 대해이 절차를 반복합니다. 여기, 우리는 transfection 시약 같은 표준 절차 및 oligofectamine (Invitrogen) 다음과 같은 양식 헬라 세포를 사용합니다.
- 최적의 transfection 조건을 선택하는 mitotic 연금 (원형 모양)과 가벼운 현미경에 의해 renilla - 루시페라제 (RLUC) esiRNA와 transfected 세포의 총 수를 표시 Eg5 esiRNAs와 transfected 세포를 계산합니다. RLUC에 대한 최소한 독성 및 Eg5에 가장 발음 표현형과 조건을 선택합니다.
transfection 조건을 최적화하기위한 대안 방법은 구성적인 활성 발기인의 통제하에 EGFP (또는 다른 적절한 리포터 유전자) 표현 안정 세포주를 포함합니다. EGFP (또는 다른 리포터 유전자)와 RLUC (또는 다른 적절한 대조군의 esiRNA) 예 : 형광 도움 셀 정렬 (외과)에 의해 측정 노크 다운 효능과 독성에 대한 esiRNA의 transfection 후. EGFP에 대한 사용 esiRNA이 대상 - mRNA에 완전히 보완되어 있는지 확인합니다.
3. 기본 화면에게 5,6 설정
- 자동 pipetting 역 (예 : 물병자리, Tecan과 WellMate, 매트릭스)에 사용되는 모든 구성 요소에 대한 pipetting 정밀도를 최적화합니다. pipetting 매개 변수는 솔루션 볼륨 및 플레이트 타입의 종류에 따라 변경이 때문에 최적화가 별도로 매 단계마다 반복되어야한다. 가능하다면, pipetting 역은 contaminations을 피하기 위해 층류 후드 아래에 배치해야합니다. 모든 사용하는 구성 요소가 해당되는 경우 autoclaving 또는 75 % 에탄올로 분사하여 하나를 사용하기 전에 살균해야합니다. 잘부터 교차 오염이 잘 제외되도록 빨래 프로토콜을 최적화합니다. 자동 pipetting의 최적화에 대한 자세한 내용은 공간 제약에 대한 제공 및 활용 pipetting 스테이션에 크게 의존 수 없습니다. 자세한 내용은 프로토콜을 제조를 참조하십시오.
- Eg5 및 RLUC에 대한 esiRNAs 위의에서 최적의 조건을 사용하여 384 자 형식으로 Transfect 세포. 전체 접시를 덮고 Eg5 및 RLUC esiRNA위한 교류 패턴을 사용합니다.
- 48 시간 동안 배양 감기 100 % 에탄올로 세포를 수정 후, 1 μg / ML DAPI 100 μg / ML RNase A (Qiagen)를 포함하는 PBS에서 25 분 얼룩, 15 분 동안 PBS에 rehydrate. 마지막으로 4 PBS 및 저장과 함께 씻어 ° C.
- 올림푸스 ScanR 시스템에 현미경의 예에서 DAPI - 형광의 측정 강도. 휴대폰 번호에 대한 DAPI 강도를 계획하여 히스토그램을 생성하고 G1 - 단계에 대한 DNA - 컨텐츠 2N과 함께 세포의 비율을 계산하여 세포주기의 분포를 평가, <2N> S - 단계에 대한 4N, G2/M-phase에 대한 4N과 aneuploidy / polyploidy위한> 4N.
- 접시 위에 결과의 균등을 평가해보십시오. 결과가 위치 effe를 제외 현저하게 다를 경우에는 추가 최적화가 필요합니다CTS. 멀티 잘 접시를 사용하는 일반적인 문제는 배양 시간 동안 가장자리의 우물에서 향상된 증발됩니다. 이것은 종종 플레이트 위치 특정 효과 번역 다른 우물에서 다양한 실험 조건에 연결됩니다. 이러한 이유로, 우리는 화면 빈 모든 모서리 우물을 떠날 것이 좋습니다. 더 이상 증발이 incubators는 높은 습도에서 보관하고 있는지 확인 최소화합니다. 우리는 또한 정기적으로 이러한 증발을 차단 코닝 통풍 씰링 테이프로 증발 장벽을 사용합니다. 위치 효과에 대한 다른 리소스를 고려, 판독 시스템의 예를 들어 기술 변화 (현미경, 플레이트 판독기 등) 또는 액체 처리 변화 (그라디언트, 솔루션 등의 inhomogeneity)로 이동해야합니다.
- 긍정적이고 부정적인 컨트롤 사이의 통계적 차이는 사용된 분석의 중요성에 대한 측정을 제공합니다. 대조군 (또는 배경 소음, 모의 제어) 사이의 큰 차이와 예제는 실제 심사를 시작하기 전에 설치되어야한다. 통계적 의미에 대한 좋은 측정 Z - 요소입니다. Z - 인자는 다음과 같은 방정식 계산됩니다 :
Z = 1 - (3 SD [샘플] + 3 SD [모의]) * (| 아베 [샘플] - 아베 [모의] |) -1, SD와 함께 : 표준 편차, 아베 : 평균. 1 Z - 팩터> Z> 0.5은 긍정적인 제어 7 부정적인 컨트롤의 통계적으로 의미 분리 (소음)을 나타냅니다.
4. 기본 화면
- 위에서 최적의 조건을 활용 esiRNAs의 transfection을위한 384 잘 조직 문화 접시를 준비합니다. 여기, 우리는 당 잘 5μl TE 버퍼에 용해 15ng esiRNA을 사용합니다. 판 당 적어도 8 제어 위치가 연구 생물 학적 과정에 적합한 긍정적이고 부정적인 컨트롤 (Eg5 및 RLUC 여기)를로드해야합니다. 방지 위치 효과에 가장자리 우물은 5μl TE 버퍼로로드됩니다.
- 물론 당 0.2μl Oligofectamine을 포함 5μl OptiMEM을 (Invitrogen) 추가 혼합하고 실온에서 20 분 동안 품어.
- 72 시간과 부화; (물론 1000 세포에 해당하는 25 셀 / μl 농도에서 헬라의 세포 현탁액의 40μl 여기) transfection 혼합물에 세포 현탁액을 추가합니다.
- 자동 현미경 (올림푸스 ScanR, 위 참조)에서 DNA - 컨텐츠를 측정합니다. Z - 점수는 참고 자료로 부정적인 제어에 대한 신호를 사용하는 모든 샘플 esiRNAs 계산됩니다 히트 선택에 대한 Z - 점수 통계를 사용하여 평가합니다. 참고 Z - 점수는 Z - 요소와 동일하지 않습니다. Z - 점수 (모형) 제어에 비해 샘플 가치의 중요성에 대한 통계 측정을 제공합니다. 이것은 방정식 다음과 계산됩니다 :
Z = (값 [샘플] - 평균 [모의]) * 표준 편차 [조롱] -1.
히트 선택에 대한 임계값 적용되어야한다. 일반적으로 중요한 기준처럼 : 2 <Z <-2를 사용하지만, 데이터 세트의 품질에 따라 생물 학적 처리하거나 화면의 범위를 연구이며, 서로 다른 임계값을 적용할 수 있습니다. 상당히 쉬운 Z - 점수 통계 옆에 또한 더 정교한 수학 평가 방법 (심사 자료의 통계적 평가의 넓은 필드에 첫 번째 내부는 말로 외에서 찾을 수 있습니다. 8) 사용할 수 있습니다.
5. 보조 화면과 히트 검증
- 보조 화면이 실험 오류 또는 해제 - 대상 효과에 의한 잘못된 반응을 제거하기 위해 기본 화면을 따릅니다. 선택 조회에 대해 기본 화면에서 사용되는 것과 동일한 절차는 더 나은 통계 평가를 허용하는 복제의 큰 숫자 (3-5)을 반복해야합니다.
- 확인 조회에 대해 초기 화면에서 확인된 목표에 대한 보조가 아닌 중복 esiRNA (또는 다른 비 중복 입을 트리거)를 사용해야합니다. 동일한 분석과 읽기 아웃이 기본 화면으로 적용되어야합니다.
- 궁극적으로 선택된 유전자는 교차 종 RNAi 구조 9 확인할 수 있습니다. 함으로써 유전자의 마우스 ortholog 예를 들어 세균 인공 염색체 (BAC) 인코딩 안정 세포로 transfected 있습니다. BAC - 구조의 게놈 맥락에서 유전자를 보존하고 거의 - 생리적 표현을위한 수 있습니다. 내생 인간의 유전자에 대한 RNAi은 RNAi - 표현형을 구출 마우스 transgene 발현 변형을 떠날 것입니다. RNAi - 구조 날짜에 사용할 RNAi의 phenotypes의 검증을위한 황금 표준을 제공합니다.
- 마지막으로, 검증된 후보는 결국 기계론의 이해를 유도하기 위해 자세히 연구하고 있습니다. 많은 경우에 RNAi는 차, 더 정교한 assays에서 예,이 실험에서 사용할 수 있습니다.
Discussion
RNA 간섭은 손실 기능 phenotypes을 연구하는 표준 기술이되었습니다. RNAi - 중재자의 대규모 컬렉션 서로 다른 공급 업체에서 사용할 수 있으며, 유전자 입을위한 쉽고 비용 효과적이고 신속한 방법을 제공합니다. 이것은 다른 종과 세포 유형의 다양한 범위에 게놈 규모의 관점을 허용 많은 생물 학적 과정에서 키 플레이어 체계적인 심사를 위해 문을 열었습니다.
높은 거짓 긍정과 거짓 부정적인 요금은 RNAi 화면에서 일반 과제입니다. 이 문제를 해결하기 위해 상당한 노력은 효능을 향상시키기 위해 투자하고 특히 입을의 특이성이 트리거되었습니다. 중요한 발견은 동일한 증명서를 대상으로 다양한 siRNAs의 수영장 크게 타겟 특이성을 향상 것이었습니다. 다른 siRNAs 매우 복잡한 수영장이 endoribonuclease에 의해 생산되기 때문에 esiRNAs는 RNAi 화면에서 거짓 긍정적인 속도를 줄이고, 높은 목표 특이성 트리거입니다. esiRNAs도 또한 잘못된 부정적인 속도를 줄이고, 효율적인 knockdowns 달성을 증명하고있다.
RNAi 스크린은 기술적으로 요구되기 때문에, 그들은 가능성이 몇 시간 동안 일상적으로 수행하기 어려운 상태로 유지됩니다. 시약 및 악기 더 많은 실험실들이 전문 지식을 공유 얻을 그러나, 현대 생물학의 RNAi 화면의 사용은 향후 증가할 것으로 간주됩니다.
Disclosures
저자는 제출된 작품에 관심이있을 상업 기관과 금융 관계를 선언합니다.
Acknowledgments
우리는 토론을위한 뷰큘츠 실험실과 시그마 - 알드리치 RNAi - 팀 구성원을 인정하고 싶습니다. 우리는 맥스 플랑크 사회와 Bundesministerium FÜR Bildung 놀이 Forschung 그랜즈 [0315105] 지원을위한 이동 - 바이오에게 감사를 표합니다.
선교 ®는 시그마 - 알드리치 생명 공학 LP의 등록 상표입니다
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MISSION esiRNA | Sigma-Aldrich | For additional information contact: rnai@sial.com | |
| Wellmate | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| Breathable sealing tape | Corning | Breathable Sealing Tape, Sterile (Product #3345) | |
| OptiMEM | Invitrogen | ||
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | 200 proof (absolute), for molecular biology |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P5493 | BioReagent, 10x concentrate, suitable for cell culture, for molecular biology |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Sigma-Aldrich | D8417 | Poweder, BioReagent, suitable for cell culture, >98% (HPLC and TLC) |
| Ribonuclease A from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | R6513 | For molecular biology, ≥70 Kunitz units/mg protein, lyophilized powder |
| Tris-EDTA buffer solution | Sigma-Aldrich | T9285 | 100 x, for molecular biology |
References
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