Summary
Aqui usamos uma biblioteca esiRNA humanos em uma tela de high-throughput de genes envolvidos na divisão celular. Demonstramos como configurar e realizar uma esiRNA telas, bem como a forma de analisar e validar os resultados.
Abstract
Interferência de RNA (RNAi) é um mecanismo básico celular para o controle da expressão gênica. RNAi é induzida por curto double-stranded RNA também conhecido como pequenos RNAs de interferência (siRNAs). A curto double-stranded RNA provenientes de mais de casal precursores presos pela atividade de Dicer, uma proteína da família III RNase de endonucleases. Os fragmentos resultantes são componentes do RNA induzida silenciamento complexos (RISC), direcionando-a para o mRNA alvo cognato. RISC cliva o mRNA alvo, reduzindo assim a expressão da proteína codificada 1,2,3. RNAi tem se tornado um método poderoso e amplamente utilizado experimental para a perda de estudos a função do gene em células de mamíferos utilizando pequenos RNAs de interferência.
Atualmente dois métodos principais estão disponíveis para a produção de pequenos RNAs de interferência. Um método envolve a síntese química, ao passo que um método alternativo emprega clivagem endonucleolítica de alvo específico long double-stranded RNA pela RNase III in vitro. Assim, uma piscina diversificado de siRNA-like oligonucleotides é produzido, que é também conhecido como endoribonuclease preparados siRNA ou esiRNA. Uma comparação da eficácia dos siRNAs quimicamente derivados e esiRNAs mostra que ambos os gatilhos são potentes no alvo gene-silenciamento. Diferenças podem, no entanto, ser visto quando se compara especificidade. Muitos única siRNAs sintetizados quimicamente produzem proeminente fora do alvo os efeitos, enquanto que a mistura complexa inerente esiRNAs leva a um knockdown mais específico 10.
Neste estudo, nós apresentamos o projeto do genoma escala bibliotecas MISSÃO esiRNA e sua utilização para RNAi triagem exemplificado por uma tela de DNA de conteúdo para a identificação de genes envolvidos na progressão do ciclo celular. Vamos mostrar como otimizar o protocolo de transfecção e no teste de triagem em alta taxa de transferência. Também demonstramos como grande conjuntos de dados podem ser avaliados estatisticamente e apresentar métodos para validar visitas primária. Finalmente, damos potenciais pontos de partida para outras caracterizações funcionais de visitas validado.
Protocol
1. Alta qualidade esiRNA bibliotecas MISSÃO
- Para cada gene de interesse da região-alvo mais sensíveis e específicas para RNAi é escolhido utilizando o algoritmo DEQOR (http://cluster-1.mpi-cbg.de/Deqor/deqor.html). Quatro pontuações DEQOR o potencial silenciamento de todas as possível 21 nucleotídeos siRNAs longos em um alvo mRNA baseada em state-of-the-art design 4 restrições. Além disso, cada siRNA potencial é analisado para possível reatividade cruzada com outros genes através da realização de uma pesquisa BLAST contra o transcriptoma do organismo estudado. O programa fornece, assim, uma análise da qualidade global e cross-silenciamento capacidades dos esiRNA potencial (300-600 duração bp).
- A região escolhida do alvo gene-cDNA é amplificado por PCR usando primers gene-específicos flanqueado por RNA-polimerase bacteriófago promotor-seqüências.
- Cada produto de PCR utilizado para a produção esiRNA MISSÃO é verificada a identidade através do seqüenciamento e análise de pureza, Caliper Labchip.
- Long double-stranded RNA é transcrito a partir do PCR-RNA polimerase produto, seguido de um recozimento dos fios transcritas.
- esiRNAs são preparados por digestão enzimática limitada do long double-stranded RNA usando RNaseIII seguidos de purificação através de cromatografia de troca aniônica, utilizando colunas de Q-sepharose spin.
- esiRNAs são precipitadas e ressuspendidas em tampão TE. O rendimento é medido pela absorção de UV-medições ea concentração é ajustada pela dissolução em um volume adequado de tampão TE. A qualidade global do produto final está marcada pela Caliper análise Labchip.
2. Escolhendo uma linha celular e otimização de transfecção para a seleção
- Titular quantidades de esiRNA (use EG5 como positivo e renilla-luciferase como controle negativo) e quantidades crescentes de reagentes de transfecção em uma placa de 384 poços, adicionar células e incubar por 48 horas. EG5 é uma proteína do motor kinesin necessários para a montagem do eixo bipolar e esgotamento leva a uma paragem da mitose. Repita este procedimento para os reagentes de transfecção e diferentes linhagens celulares. Aqui, usamos células HeLa cultivadas seguindo procedimentos padrão e oligofectamine (Invitrogen) como reagente de transfecção.
- Para a escolha das condições ideais de transfecção contar as células transfectadas com EG5 esiRNAs que mostram uma paragem da mitose (forma arredondada) eo número total de células transfectadas com renilla-luciferase esiRNA (RLUC) por microscopia de luz. Escolha o estado com a menor toxicidade para RLUC eo fenótipo mais pronunciada para EG5.
Um método alternativo para otimização das condições de transfecção envolve uma linha celular estável expressando EGFP (ou outro gene repórter adequados) sob o controle de um promotor constitutivo ativo. Após a transfecção de um esiRNA contra EGFP (ou outro gene repórter) e RLUC (ou outro esiRNA controle adequado negativo) eficácia medida knock-down e toxicidade por separação de células por exemplo fluorescência assistida (FACS). Certifique-se que o esiRNA usado para EGFP é totalmente complementar ao mRNA-alvo.
3. Configurando a tela de 5,6 Primária
- Otimizar a precisão de pipetagem para todos os componentes usados em uma estação de pipetagem automática (por exemplo, Aquarius, Tecan e WellMate, Matrix). Porque os parâmetros de pipetagem mudar, dependendo do tipo de tipo de volume de solução, ea placa esta otimização tem que ser repetido para cada etapa separadamente. Se possível, a estação de pipetagem deve ser colocado sob uma capela de fluxo laminar para evitar contaminações. Todos os componentes utilizados devem ser higienizados antes do uso, quer em autoclave, se aplicável, ou por aspersão com etanol 75%. Otimizar protocolos de lavagem, para que a contaminação cruzada de bem para o bem é excluído. Detalhes para a otimização de pipetagem automática não pode ser dar para o espaço-constrangimentos e dependem em grande parte da estação de pipetagem utilizada. Para mais informações consulte a fabrica de protocolo.
- Transfecção de células em formato de 384 poços, utilizando as condições otimizadas de cima com esiRNAs para EG5 e RLUC. Use um padrão alternado para EG5 e esiRNA RLUC cobrindo toda a placa.
- Após a incubação por 48 horas fixar as células com 100% de etanol frio, hidratar em PBS por 15 minutos, mancha por 25 minutos em PBS contendo 1 mg / ml DAPI e 100 mg / ml de RNase A (Qiagen). Finalmente, lavar com PBS e armazenar a 4 ° C.
- Medida de intensidade de fluorescência de DAPI-por exemplo, em um sistema de microscopia ScanR Olympus. Gerar um histograma de intensidade por conspirar contra o DAPI número de células e avaliar a distribuição do ciclo celular através do cálculo do percentual de células com o DNA 2N conteúdo para a fase G1; <2N> 4N para S-fase; 4N para G2/M-phase e > 4N para aneuploidia / poliploidia.
- Avaliar a homogeneidade dos resultados sobre a placa. Otimização é necessária se os resultados diferem significativamente para excluir effe posiçãocts. Um problema comum quando se utiliza multi-placas é bem maior evaporação nos poços vantagem durante o tempo de incubação. Isto leva a diferentes condições experimentais em poços diferentes, que muitas vezes se traduz em placa-position efeitos específicos. Por este motivo, recomendamos deixar todos os poços borda vazia para uma tela. Para minimizar ainda mais a evaporação se certificar de que as incubadoras são mantidos em umidade alta. Nós também rotineiramente empregam barreiras evaporação, como Corning A fita de vedação respirável que bloqueiam a evaporação. Recursos também outros para efeitos da posição tem que ser levados em consideração, por exemplo, variação da técnica do sistema de leitura (microscópio leitor de placas, etc) ou variações de manipulação de líquidos (gradientes, heterogeneidade de soluções, etc).
- As diferenças estatísticas entre os controles positivos e negativos fornecer uma medida para a importância do doseamento utilizados. A grande diferença entre o controle negativo (ou ruído de fundo; mock-controle) e da amostra tem de ser estabelecida antes de iniciar o rastreio real. Uma boa medida para a significância estatística é o factor-Z. O Z-fator é calculado segundo a equação:
Z = 1 - (3 SD [amostra] + 3 SD [simulação]) * (| Av. [amostra] - Av. [simulação] |) -1; com SD: desvio padrão; Av: média. A Z-fator de 1> Z> 0,5 indica uma separação estatisticamente significativa de controles negativos (e ruído) dos controles positivos 7.
4. Tela principal
- Prepare 384 poços placas de cultura de tecidos para a transfecção de esiRNAs utilizando as condições otimizadas de cima. Aqui, usamos esiRNA 15ng por poço dissolvido em 5μl tampão TE. Pelo menos oito posições de controle por placa deve ser carregado com adequados controles positivos e negativos para o processo biológico em estudo (aqui: EG5 e RLUC). Para evitar efeitos de borda posição dos poços são carregados com 5μl tampão TE apenas.
- Adicionar 5μl OptiMEM (Invitrogen) contendo Oligofectamine 0.2μl por poço, misturar e incubar por 20 minutos em temperatura ambiente.
- Adicionar suspensão celular sobre a mistura de transfecção (aqui: 40μl de uma suspensão de células HeLa a 25 células / mL de concentração; equivalente a 1.000 células por poço) e incubar por 72 horas.
- Medida DNA de conteúdo em um microscópio automatizado (Olympus ScanR, veja acima). Avaliar usando Z-score estatísticas para a seleção hit: Z-scores são calculados para todos os esiRNAs amostra usando o sinal para o controle negativo como referência. Nota, o Z-score não é o mesmo que o factor-Z. Z-scores fornecem uma medida estatística de significância dos valores da amostra em comparação com um controle (mock-). É calculado de acordo com a equação:
Z = (valor [Sample] - média [simulação]) * desvio-padrão [simulação] -1.
Para a seleção bateu um limite tem de ser aplicado. Tipicamente, um critério de importância, como: 2 <Z <-2 é usado, mas dependendo da qualidade do conjunto de dados, o estudo processo biológico ou simplesmente o escopo da tela, diferentes limiares podem ser aplicáveis. Ao lado do razoavelmente fácil Z-score estatísticas também mais elaboradas métodos de avaliação matemática pode ser usada (a primeira no interior amplo campo de avaliação estatística de dados de rastreio podem ser encontrados em Malo et al. 8).
5. Tela secundária e validação hit
- A tela secundária segue a tela principal para eliminar falsos positivos devido a erros experimentais ou fora do alvo efeitos. Para os hits selecionados o mesmo procedimento utilizado na tela principal deve ser repetido para um número maior de repetições (3-5) para permitir uma melhor avaliação estatística.
- Por sucessos verificados um esiRNA secundário que não se sobrepõem (ou outro gatilho silenciamento não sobrepostos) contra os alvos identificados nas telas iniciais devem ser utilizados. Mesmo ensaio e leia-out deve ser aplicada como para a tela principal.
- Em última análise, os genes selecionados podem ser validadas pelo cross-espécies de resgate RNAi 9. Assim, um cromossomo bacteriano artificial codificação (BAC) por exemplo, o rato ortólogo do gene é estavelmente transfectadas em células. BAC-construções de preservar um gene em seu contexto genômico e permitir uma expressão quase-fisiológica. RNAi contra o gene endógeno humano vai deixar a expressão do transgene rato inalterada que resgata a RNAi-fenótipo. RNAi-resgate fornece o padrão-ouro para a verificação de fenótipos RNAi disponíveis até à data.
- Finalmente, os candidatos validados são estudados em mais detalhes para finalmente obter a compreensão mecanicista. Em muitos casos RNAi pode ser usado nesses experimentos, por exemplo, no secundário, testes mais elaborados.
Discussion
Interferência de RNA tem se tornado uma técnica padrão para o estudo de perda de função-fenótipos. Grande escala coleções de RNAi-mediadores estão disponíveis a partir de diferentes fornecedores e fornecer um método fácil, econômico e rápido para silenciamento de genes. Este abriu o portão para a triagem sistemática para atores-chave em muitos processos biológicos que permite uma perspectiva de escala do genoma em uma ampla gama de diferentes espécies e tipos de células.
Alta de falsos positivos e falsos negativos são as taxas de um desafio comum em telas de RNAi. Para resolver este problema, esforços consideráveis foram investidos para melhorar a eficácia e, em particular a especificidade do silenciamento triggers. Uma descoberta importante foi que um grupo de siRNAs diferentes visando a transcrição mesma aumenta muito a especificidade alvo. Porque uma piscina muito complexa de diferentes siRNAs é produzido pela endoribonuclease, esiRNAs são gatilhos alta especificidade alvo, reduzindo a taxa de falsos positivos em telas de RNAi. esiRNAs também demonstraram para atingir knockdowns eficiente, reduzindo também a taxa de falso negativo.
Porque as telas de RNAi são tecnicamente exigentes, que provavelmente permanecerá desafiador para realizar de forma rotineira por algum tempo. No entanto, como reagentes e instrumentos de laboratórios obter melhor e mais compartilhar seus conhecimentos, o uso de telas de RNAi na biologia moderna são considerados para aumentar no futuro.
Disclosures
Autores declaram relações financeiras com entidades comerciais que possam ter interesse no trabalho apresentado.
Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer os membros do laboratório Buchholz eo Sigma-Aldrich RNAi-time para a discussão. Gostaríamos de agradecer ao Max Planck Society eo Bundesministerium für Bildung und Forschung grands Go-Bio [0315105] para suporte.
MISSÃO ® é uma marca registrada da LP Biotecnologia Sigma-Aldrich
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MISSION esiRNA | Sigma-Aldrich | For additional information contact: rnai@sial.com | |
| Wellmate | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| Breathable sealing tape | Corning | Breathable Sealing Tape, Sterile (Product #3345) | |
| OptiMEM | Invitrogen | ||
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | 200 proof (absolute), for molecular biology |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P5493 | BioReagent, 10x concentrate, suitable for cell culture, for molecular biology |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Sigma-Aldrich | D8417 | Poweder, BioReagent, suitable for cell culture, >98% (HPLC and TLC) |
| Ribonuclease A from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | R6513 | For molecular biology, ≥70 Kunitz units/mg protein, lyophilized powder |
| Tris-EDTA buffer solution | Sigma-Aldrich | T9285 | 100 x, for molecular biology |
References
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