Drosophila Larva Imaginal Disc Dissektion: Eine Methode, um die Entwicklung von Epithelien zu beobachten

Overview

Bei der Färbung drosophila imaginärer Scheiben wird oft eine grobe Zerlegung durchgeführt, bei der die Scheiben freigelegt werden, aber am Körper befestigt bleiben. Einmal gebeizt, werden die Scheiben von Interesse isoliert und montiert. Das Beispielprotokoll zeigt ein Verfahren zur Flügelscheibenzerlegung und -montage.

Protocol

Dieses Protokoll ist ein Auszug aus Morimoto und Tamori, Induktion und Diagnose von Tumoren in Drosophila Imaginal Disc Epithelia, J. Vis. Exp. (2017).

1. Larven-Sektion

1. Sammeln Sie wandernde dritte Instar-Larven mit einem Holzstab oder stumpfer Zange, genotypisieren Sie sie durch geeignete Fluoreszenzmarker(z.B.EGFP) unter einem fluoreszenzsteroskopischen Mikroskop und legen Sie sie in eine Sezierschale mit PBS (Phosphatgepufferte Saline).
2. Waschen Sie die Larven in PBS durch Pipettieren mit 2 ml Kunststoff-Transferpipetten.
3. Kneifen Sie die Mitte der Larve mit einer Zange und reißen Sie den Körper in der Hälfte mit den anderen Zangen.
4. Kneifen Sie den Mundhaken der vorderen Hälfte mit einer Zange und drücken Sie den Mund in Richtung des Körpers mit den anderen Zangen, um den Körper von innen nach außen zu drehen.
5. Entfernen Sie unnötige Materialien wie Speicheldrüsen oder Fettkörper mit Zange.

2. Fixierung und Antikörperfärbung

1. Die sezierte Vorderhälfte des Larvenkörpers (einschließlich imaginärer Flügelscheiben) auf ein 1,5 ml Kunststoffrohr übertragen und in 1 ml Fixlösung (4% Formaldehyd in PBS) für 10 min bei Raumtemperatur im Dunkeln mit sanfter Rotation fixieren.
   ACHTUNG: Formaldehyd ist giftig und hat ein krebserregendes Potenzial. Tragen Sie Schutzhandschuhe und Kleidung, um Hautkontakt zu verhindern.
   HINWEIS: In diesem Teil finden alle Schritte auf einem Nutator bei Raumtemperatur im Dunkeln statt, sofern nicht anders vermerkt.
2. Entfernen Sie die Fix-Lösung, und verwerfen Sie sie. Waschen Sie das Gewebe mit 1 ml PBT (0,3% Triton X-100 in PBS) dreimal für jeweils 15 min.
3. Entfernen Sie die PBT und fügen Sie 1 ml PBTG (0,2% Rinderserumalbumin und 5% normales Ziegenserum in PBT) zum Blockieren und Nutaten von 1 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 °C hinzu.
4. Entfernen Sie PBTG und fügen Sie die mit PBTG entsprechend verdünnte Primärantikörperlösung hinzu (siehe Materialtabelle) und über Nacht bei 4 °C nutaten.
5. Entfernen Sie die primäre Antikörperlösung und waschen Sie das Gewebe mit 1 ml PBT dreimal für jeweils 15 min.
6. Entfernen Sie PBT und fügen Sie sekundäre Antikörperlösung entsprechend mit PBTG (1:400) verdünnt. Nutieren Sie für 2 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 °C.
7. Sekundäre Antikörperlösung entfernen und gewebe nieren sie mit 1 ml PBT zweimal für jeweils 15 min.
8. Um F-Actin zu färben, entfernen Sie PBT und fügen Sie die in PBS (1:40) entsprechend verdünnte Phalloidin-Lösung hinzu. Dann für 20 min nussen. Entfernen Sie die Phalloidin-Lösung und waschen Sie das Gewebe mit 1 ml PBT zweimal für jeweils 15 min.
9. Um der Kern-DNA entgegenzuwirken, entfernen Sie PBT und fügen Sie dAPI (4', 6-Diamidino-2-Phenylindole) Lösung (0,5 g/ml DAPI in PBS) hinzu. Dann 10 min nutieren.
   ACHTUNG: DAPI hat ein krebserregendes Potenzial. Tragen Sie Schutzhandschuhe und Kleidung, um Hautkontakt zu verhindern.
10. Entfernen Sie die DAPI-Lösung und waschen Sie das Gewebe mit 1 ml PBT zweimal für jeweils 15 min.
11. Einmal in 1 ml PBS für 10 min bei Raumtemperatur abspülen.
12. Entfernen Sie PBS und fügen Sie 500 l 100 % Glycerin als Vormontagemedium hinzu.

3. Montage auf Mikroskop-Dias

1. Legen Sie das gebeizte Gewebe mit einer 2 ml Kunststoff-Transferpipette auf ein Mikroskopschlitten.
2. Übertragen Sie das Gewebe auf Tropfen des Montagemediums auf einem anderen Mikroskopschlitten mit Zange.
3. Halten Sie das Ende des sezierten Gewebes mit einer Zange gedrückt und ziehen Sie Gehirn- und Augenantennenscheiben mit den anderen Zangen weg.
   HINWEIS: Halten Sie die sezierten Gehirne, um sie in der Nähe der Flügel imaginäre Nscheiben zu platzieren. Die Gehirne fungieren als Plattform, die verhindert, dass der Deckelrutsch die imaginären Flügelscheiben zerquetscht.
4. Um den Flügel imaginäre Scheiben zu isolieren halten Sie das Ende des sezierten Gewebes mit einer Zange und kratzen sanft die Körperwand und reißen Sie die Scheiben mit den anderen Zangen.
   HINWEIS: Wenn es schwierig ist, Flügelimaginäre Scheiben zu finden, schälen Sie die Luftröhre vom Hinterteil zur vorderen Seite. Flügelimaginäre Scheiben kleben an der Luftröhre.
5. Bedecken Sie die imaginären Scheiben vorsichtig mit einem Deckelund versiegeln Sie mit Nagellack; bei 4 °C lagern.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Phosphate buffered saline (PBS)	Wako	162-19321
TritonX-100	Wako	168-11805
Formaldehyde	Wako	064-00406
bovine serum albumin	Sigma	A7906
normal goat serum	Sigma	G6767
mounting medium, Vectashield	Vector Laboratories	H-1000
DAPI	Sigma	D9542
mouse-anti-Dlg 4F3	Developmental Studies Hybridoma Bank	4F3 anti-discs large, RRID:AB_528203	dilute in PBTG, 1:40
mouse-anti-MMP1	Developmental Studies Hybridoma Bank	3A6B4, RRID:AB_579780	3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40
mouse-anti-MMP1	Developmental Studies Hybridoma Bank	3B8D12, RRID:AB_579781	3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40
mouse-anti-MMP1	Developmental Studies Hybridoma Bank	5H7B11, RRID:AB_579779	3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40
mouse-anti-atubulin	Developmental Studies Hybridoma Bank	AA4.3, RRID:AB_579793	dilute in PBTG, 1:100
Alexa Fluor 546 Phalloidin	Molecular probes	A22283	dilute in PBS, 1:40
goat anti-mouse IgG antibody, Alexa Fluor 546	Molecular probes	A11030	dilute in PBTG, 1:400
Fly strains
sd-Gal4	Bloomington Drosophila Stock Center	#8609	recombined with UAS-EGFP
upd-Gal4	Bloomington Drosophila Stock Center	#26796	recombined with UAS-EGFP
UAS-lgl-RNAi	Vienna Drosophila RNAi center	#51247
UAS-scrib-RNAi	Vienna Drosophila RNAi center	#105412
UAS-RasV12	Bloomington Drosophila Stock Center	#64196
UAS-Yki3SA	Bloomington Drosophila Stock Center	#28817
hsFLP	Bloomington Drosophila Stock Center	#6
Act>CD2>GAL4 (flip-out GAL4)	Bloomington Drosophila Stock Center	#4780	recombined with UAS-EGFP
UAS-EGFP	Bloomington Drosophila Stock Center	#5428	X chromosome
UAS-EGFP	Bloomington Drosophila Stock Center	#6658	third chromosome
UAS-Dicer2	Bloomington Drosophila Stock Center	#24650	second chromosome
UAS-Dicer2	Bloomington Drosophila Stock Center	#24651	third chromosome
vkg-GFP	Morin et al. 2001		GFP protein trap