ショウジョウバエ 幼虫の円盤切除:上皮の発達を観察する方法

Overview

ショウジョウバエのイマジナルディスクを染色する場合、ディスクが露出しているが体に付着したままで大まかな解剖が行われることが多い。染色されると、関心のあるディスクが分離され、マウントされます。このプロトコル例は、翼のイマジナルディスク解剖と取り付けの手順を示しています。

Protocol

このプロトコルは、森本とタモリからの抜粋であり、 ショウジョウバエ イマジナルディスク上皮部の腫瘍の誘導と診断、J.Vis. Exp.(2017年)

1. 幼虫の解剖

1. 木製の棒または鈍い鉗子を持つ3番目のインスター幼虫を収集し、蛍光立体顕微鏡(例えば、EGFP)の下で適切な蛍光マーカー(例えば、EGFP)でそれらを遺伝子タイプし、PBS(リン酸緩衝生理食塩水)と解剖皿に入れます。
2. 2 mLプラスチック転写ピペットでピペット処理して、PBSで幼虫を洗浄します。
3. 一方の鉗子で幼虫の中心をつまみ、他の鉗子で体を半分に引き裂きます。
4. 一方の鉗子で前部半分の口フックをつまみ、他の鉗子で口を体に向かって押して体を裏返します。
5. 唾液腺や脂肪体などの不要な物質を鉗子で除去します。

2. 固定および抗体染色

1. 幼虫体(イマジナルウィングディスクを含む)の解剖前半分を1.5mLプラスチックチューブに移し、1mLのフィックス溶液(PBSでは4%ホルムアルデヒド)を暗闇の中で穏やかな回転で室温で10分間固定します。
   注意: ホルムアルデヒドは毒性があり、発がん性があります。皮膚の接触を防ぐために、保護手袋と衣服を着用してください。
   注: この部分では、特に断らない限り、すべてのステップは暗闇の中で室温でヌテーター上で行われます。
2. 修正ソリューションを削除し、破棄します。PBT(PBSでは0.3%トリトンX-100)を1mLで1mLずつ15分間洗浄します。
3. PBTを取り除き、室温または4°Cで1時間を遮断し、1時間を加えるPBTG(PBTでは0.2%のウシ血清アルブミンおよび5%正常なヤギ血清)を加えます。
4. PBTGを除去し、PBTGで適切に希釈した一次抗体溶液を添加し( 材料表を参照)、4°Cで一晩に変異します。
5. 一次抗体溶液を取り出し、1mL PBTで各15分間3回洗浄します。
6. PBTを除去し、PBTGで適切に希釈した二次抗体溶液を添加する(1:400)。室温で2時間、または4°Cで一晩にヌテートする。
7. 二次抗体溶液を取り除き、PBTの1mLをそれぞれ15分間2回洗浄します。
8. F-アクチンを染色するには、PBTを取り除き、PBSで適切に希釈したファロイジン溶液を添加する(1:40)。その後、20分間ヌーターします。ファロイジン溶液を取り出し、PBTの1mLをそれぞれ15分間2回洗浄します。
9. 核DNAを除去するには、PBTを取り除き、DAPI(4',6-ジミジノ-2-フェニリンドール)溶液(PBSでDAPIの0.5 μg/mL)を加えます。その後、10分をヌーテートします。
   注意: DAPIは発がん性を秘めています。皮膚の接触を防ぐために、保護手袋と衣服を着用してください。
10. DAPI溶液を取り除き、PBTの1mLをそれぞれ15分間2回洗浄します。
11. PBSの1mLに1回、室温で10分間リンスします。
12. PBSを取り除き、プリマウント媒体として100%グリセロールの500 μLを加えます。

3. 顕微鏡スライドへの取り付け

1. 2 mLプラスチック転写ピペットを使用して、染色した組織を顕微鏡スライドに置きます。
2. 鉗子と別の顕微鏡スライドに取り付け媒体の滴にティッシュを移す。
3. 解剖された組織の端を1つの鉗子で押さえ、他の鉗子で脳および眼のアンテナディスクを引き離す。
   注: 解剖された脳を保管して、翼の想像力ディスクの近くに置きます。脳は、カバースリップが翼の想像力ディスクを押しつぶすのを防ぐプラットフォームとして機能します。
4. 翼のイマジナルディスクを分離するには、解剖された組織の端を1つの鉗子で押さえ、身体壁を静かに傷つけ、他の鉗子でディスクを引き裂く。
   注: 翼のイマジナルディスクを見つけるのが難しい場合は、後部から前側に気管を剥がします。翼の想像力ディスクは気管にくっつきます。
5. イマジナルディスクをカバースリップでそっと覆い、マニキュアで密封します。4 °Cで保管する。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Phosphate buffered saline (PBS)	Wako	162-19321
TritonX-100	Wako	168-11805
Formaldehyde	Wako	064-00406
bovine serum albumin	Sigma	A7906
normal goat serum	Sigma	G6767
mounting medium, Vectashield	Vector Laboratories	H-1000
DAPI	Sigma	D9542
mouse-anti-Dlg 4F3	Developmental Studies Hybridoma Bank	4F3 anti-discs large, RRID:AB_528203	dilute in PBTG, 1:40
mouse-anti-MMP1	Developmental Studies Hybridoma Bank	3A6B4, RRID:AB_579780	3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40
mouse-anti-MMP1	Developmental Studies Hybridoma Bank	3B8D12, RRID:AB_579781	3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40
mouse-anti-MMP1	Developmental Studies Hybridoma Bank	5H7B11, RRID:AB_579779	3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40
mouse-anti-atubulin	Developmental Studies Hybridoma Bank	AA4.3, RRID:AB_579793	dilute in PBTG, 1:100
Alexa Fluor 546 Phalloidin	Molecular probes	A22283	dilute in PBS, 1:40
goat anti-mouse IgG antibody, Alexa Fluor 546	Molecular probes	A11030	dilute in PBTG, 1:400
Fly strains
sd-Gal4	Bloomington Drosophila Stock Center	#8609	recombined with UAS-EGFP
upd-Gal4	Bloomington Drosophila Stock Center	#26796	recombined with UAS-EGFP
UAS-lgl-RNAi	Vienna Drosophila RNAi center	#51247
UAS-scrib-RNAi	Vienna Drosophila RNAi center	#105412
UAS-RasV12	Bloomington Drosophila Stock Center	#64196
UAS-Yki3SA	Bloomington Drosophila Stock Center	#28817
hsFLP	Bloomington Drosophila Stock Center	#6
Act>CD2>GAL4 (flip-out GAL4)	Bloomington Drosophila Stock Center	#4780	recombined with UAS-EGFP
UAS-EGFP	Bloomington Drosophila Stock Center	#5428	X chromosome
UAS-EGFP	Bloomington Drosophila Stock Center	#6658	third chromosome
UAS-Dicer2	Bloomington Drosophila Stock Center	#24650	second chromosome
UAS-Dicer2	Bloomington Drosophila Stock Center	#24651	third chromosome
vkg-GFP	Morin et al. 2001		GFP protein trap