Дрозофила Larva Imaginal Рассечение диска: Метод наблюдения развивающихся эпителии

Overview

При окрашивание Drosophila воображаемых дисков, часто грубое вскрытие выполняется там, где диски подвергаются, но остаются прикрепленными к телу. После того, как окрашенные, диски, представляющие интерес изолированы и установлены. Пример протокола демонстрирует процедуру вскрытия и монтажа крыла воображаемого диска.

Protocol

Этот протокол является выдержкой из Моримото и Тамори, индукции и диагностики опухолей в Drosophila Imaginal Disc Epithelia, J. Vis. Exp. (2017).

1. Вскрытие личинок

1. Соберите блуждающие третьи личинки instar с деревянной палкой или тупымимиппами, генотип их соответствующими флуоресцентными маркерами (например, EGFP) под флуоресцентным стереоскопическим микроскопом и поместите их в рассечение блюдо с PBS (фосфат буферный солевой раствор).
2. Вымойте личинки в PBS путем трубопроводов с 2 мл пластиковых трубок передачи.
3. Pinch центр личинки с одним щипся и разорвать тело пополам с другими щипся.
4. Pinch рот крючок передней половины с одним щипцей и нажмите рот к телу с другими щипцей, чтобы превратить тело наизнану.
5. Удалите ненужные материалы, такие как слюнные железы или жировые тела с хлипами.

2. Фиксация и окрашивание антител

1. Перенесите вскрытую переднюю половину личиночного тела (включая воображаемые диски крыла) в пластиковую трубку 1,5 мл и зафиксируете в 1 мл раствора Fix (4% формальдегида в PBS) в течение 10 мин при комнатной температуре в темноте с нежным вращением.
   ВНИМАНИЕ: Формальдегид токсичен и обладает канцерогенным потенциалом. Носите защитные перчатки и одежду для предотвращения контакта с кожей.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этой части, все шаги происходят на nutator при комнатной температуре в темноте, если не указано иное.
2. Удалите решение Fix и отбросьте его. Вымойте ткани с 1 мл PBT (0,3% Тритон X-100 в PBS) три раза в течение 15 минут каждый.
3. Удалить PBT и добавить 1 мл PBTG (0,2% бычьего альбумин сыворотки и 5% нормальной сыворотки козы в PBT) для блокирования и nutate 1 ч при комнатной температуре или на ночь при температуре 4 градусов по Цельсию.
4. Удалите PBTG и добавьте первичное раствор антитела, надлежащим образом разбавленный PBTG (см. таблицу материалов)и орех на ночь при 4 градусах Цельсия.
5. Удалить первичный раствор антитела и мыть ткани с 1 мл PBT три раза в течение 15 минут каждый.
6. Удалите PBT и добавьте вторичное раствор антитела, надлежащим образом разбавленный PBTG (1:400). Орех в течение 2 ч при комнатной температуре или на ночь при температуре 4 градусов по Цельсию.
7. Удалить вторичный раствор антитела и мыть ткани с 1 мл PBT два раза в течение 15 минут каждый.
8. Чтобы окрашивать F-актин, удалите PBT и добавьте фаллоидин раствор, надлежащим образом разбавленный в PBS (1:40). Затем орех в течение 20 мин. Удалить раствор фаллоидин и мыть ткани с 1 мл PBT два раза в течение 15 минут каждый.
9. Чтобы противостоять ядерной ДНК, удалите ПБТ и добавьте раствор DAPI (4', 6-diamidino-2-фенилиндол) (0,5 мкг/мл ДАПИ в PBS). Затем орех 10 мин.
   ВНИМАНИЕ: DAPI обладает канцерогенным потенциалом. Носите защитные перчатки и одежду для предотвращения контакта с кожей.
10. Удалить раствор DAPI и мыть ткани с 1 мл PBT два раза в течение 15 минут каждый.
11. Промыть один раз в 1 мл PBS в течение 10 мин при комнатной температуре.
12. Удалите PBS и добавьте 500 МКЛ 100% глицерол в качестве предварительного монтажа среды.

3. Монтаж на микроскоп слайды

1. Поместите окрашенные ткани на слайд микроскопа с помощью 2 мл пластиковой трубы передачи.
2. Перенесите ткани на капли монтажной среды на другой микроскоп слайд с типсами.
3. Удерживайте конец расчлененной ткани одним типсом и вытяните диски мозга и глаз с другими типсами.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Держите расчлененные мозги, чтобы поместить их рядом с крылом воображаемых дисков. Мозги выступают в качестве платформы предотвращения coverslip от дробления крыла мыслимых дисков.
4. Чтобы изолировать крыло мыслимые диски удерживать конец расчлененной ткани с одним типсом и осторожно поцарапать стенку тела и оторвать диски с другими типсами.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если трудно найти крыло воображаемых дисков, очистить трахею от задней до передней стороны. Крылья воображаемых дисков прилипают к трахее.
5. Аккуратно накройте воображаемые диски крышкой и запечатайте лаком для ногтей; хранить при 4 градусов по Цельсию.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Phosphate buffered saline (PBS)	Wako	162-19321
TritonX-100	Wako	168-11805
Formaldehyde	Wako	064-00406
bovine serum albumin	Sigma	A7906
normal goat serum	Sigma	G6767
mounting medium, Vectashield	Vector Laboratories	H-1000
DAPI	Sigma	D9542
mouse-anti-Dlg 4F3	Developmental Studies Hybridoma Bank	4F3 anti-discs large, RRID:AB_528203	dilute in PBTG, 1:40
mouse-anti-MMP1	Developmental Studies Hybridoma Bank	3A6B4, RRID:AB_579780	3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40
mouse-anti-MMP1	Developmental Studies Hybridoma Bank	3B8D12, RRID:AB_579781	3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40
mouse-anti-MMP1	Developmental Studies Hybridoma Bank	5H7B11, RRID:AB_579779	3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40
mouse-anti-atubulin	Developmental Studies Hybridoma Bank	AA4.3, RRID:AB_579793	dilute in PBTG, 1:100
Alexa Fluor 546 Phalloidin	Molecular probes	A22283	dilute in PBS, 1:40
goat anti-mouse IgG antibody, Alexa Fluor 546	Molecular probes	A11030	dilute in PBTG, 1:400
Fly strains
sd-Gal4	Bloomington Drosophila Stock Center	#8609	recombined with UAS-EGFP
upd-Gal4	Bloomington Drosophila Stock Center	#26796	recombined with UAS-EGFP
UAS-lgl-RNAi	Vienna Drosophila RNAi center	#51247
UAS-scrib-RNAi	Vienna Drosophila RNAi center	#105412
UAS-RasV12	Bloomington Drosophila Stock Center	#64196
UAS-Yki3SA	Bloomington Drosophila Stock Center	#28817
hsFLP	Bloomington Drosophila Stock Center	#6
Act>CD2>GAL4 (flip-out GAL4)	Bloomington Drosophila Stock Center	#4780	recombined with UAS-EGFP
UAS-EGFP	Bloomington Drosophila Stock Center	#5428	X chromosome
UAS-EGFP	Bloomington Drosophila Stock Center	#6658	third chromosome
UAS-Dicer2	Bloomington Drosophila Stock Center	#24650	second chromosome
UAS-Dicer2	Bloomington Drosophila Stock Center	#24651	third chromosome
vkg-GFP	Morin et al. 2001		GFP protein trap