Summary
Hier gebruiken we een menselijke esiRNA bibliotheek in een high-throughput screen voor genen die betrokken zijn bij de celdeling. Laten we zien hoe het opzetten en uitvoeren een esiRNA schermen, en hoe te analyseren en valideren van de resultaten.
Abstract
RNA-interferentie (RNAi) is een elementaire cellulaire mechanisme voor de controle van genexpressie. RNAi wordt veroorzaakt door korte double-stranded RNA's ook wel bekend als kleine interfererende RNA's (siRNA's). De korte dubbelstrengs RNA's zijn afkomstig uit meer dubbelstrengs voorlopers door de activiteit van Dicer, een eiwit van de RNase III familie van endonucleasen. De resulterende fragmenten zijn onderdelen van de RNA-silencing geïnduceerde complex (RISC), sturen het naar de verwante doel-mRNA. RISC klieft het doel-mRNA waardoor de expressie van het gecodeerde eiwit 1,2,3. RNAi is uitgegroeid tot een krachtige en veel gebruikte experimentele methode voor het verlies van gen functie studies in zoogdiercellen gebruik te maken van kleine interfererende RNA's.
Momenteel zijn er twee belangrijke methoden beschikbaar voor de productie van kleine interfererende RNA's. Een methode houdt in chemische synthese, terwijl een alternatieve methode maakt gebruik van endonucleolytische splitsing van doel-specifieke lange double-stranded RNA's door de RNase III in vitro. Daarbij is een gevarieerde pool van siRNA-achtige oligonucleotiden gemaakt, die ook bekend staat als endoribonuclease-en-klare siRNA of esiRNA. Een vergelijking van de werkzaamheid van chemisch afgeleid siRNA's en esiRNAs blijkt dat beide triggers zijn krachtig in het target-gen silencing. Verschillen kunnen echter worden gezien bij het vergelijken van specificiteit. Veel alleenstaande chemisch gesynthetiseerde siRNA's te produceren opvallende off-target effecten, terwijl het complexe mengsel die inherent zijn aan esiRNAs leidt tot een meer specifieke knockdown 10.
In deze studie presenteren we het ontwerp van genoom-schaal MISSION esiRNA bibliotheken en het gebruik ervan voor de RNAi screening geïllustreerd door een DNA-gehalte scherm voor de identificatie van genen die betrokken zijn in cel-cyclus progressie. We laten zien hoe je de transfectie protocol en de test voor screening in high throughput te optimaliseren. We hebben ook laten zien hoe groot data-sets kunnen statistisch worden geëvalueerd en de methoden waarop primaire treffers te valideren. Tot slot geven we mogelijke aanknopingspunten voor verdere functionele karakterisering van gevalideerde hits.
Protocol
1. Van hoge kwaliteit MISSIE esiRNA bibliotheken
- Voor elke gen van belang de meest gevoelige en specifieke doelgroepen regio voor RNAi is gekozen gebruik te maken van de DEQOR algoritme (http://cluster-1.mpi-cbg.de/Deqor/deqor.html). DEQOR 4 scoort het zwijgen op te leggen potentieel van alle mogelijk 21 nucleotiden lang siRNA's in een doel-mRNA gebaseerd op state-of-the-art design-beperkingen 4. Daarnaast wordt elke potentiële siRNA geanalyseerd op mogelijke cross-reactiviteit met andere genen door het uitvoeren van een BLAST search tegen het transcriptoom van het organisme bestudeerd. Het programma biedt daarbij een analyse van de algehele kwaliteit en cross-zwijgen capaciteiten van de potentiële esiRNA (300-600 bp lengte).
- De gekozen gebied van het target-gen cDNA wordt geamplificeerd door PCR met behulp van gen-specifieke primers geflankeerd door bacteriofaag RNA-polymerase-promoter sequenties.
- Elke PCR-product dat wordt gebruikt voor Mission esiRNA productie is geverifieerd voor de identiteit van sequencing en voor zuiverheid Caliper Labchip analyse.
- Lange double-stranded RNA wordt getranscribeerd van de PCR-product door RNA-polymerase, gevolgd door een gloeien van de getranscribeerde strengen.
- esiRNAs worden voorbereid door beperkte enzymatische afbraak van de lange double-stranded RNA met behulp van RNaseIII gevolgd door zuivering via anion-uitwisseling chromatografie gebruik te maken van Q-sepharose spin-kolommen.
- esiRNAs zijn neergeslagen en geresuspendeerd in TE-buffer. De opbrengst wordt gemeten door UV-absorptie metingen en de concentratie wordt aangepast door het oplossen in een geschikt volume van TE-buffer. De algehele kwaliteit van het eindproduct wordt gecontroleerd door Remklauw Labchip analyse.
2. Het kiezen van een cellijn en het optimaliseren van transfectie voor het screenen van
- Titreer hoeveelheden esiRNA (gebruik Eg5 als positief en renilla-luciferase als negatieve controle) en de steeds grotere hoeveelheden van de transfectie reagens in een 384-wells plaat, toe te voegen cellen en incubeer gedurende 48 uur. Eg5 is een kinesine motor eiwitten die nodig zijn voor een bipolaire assemblage van de spoel en de uitputting leidt tot een mitotische arresteren. Herhaal deze procedure voor verschillende transfectiereagentia en cellijnen. Hier gebruiken we HeLa cellen gekweekt volgens standaard procedures en oligofectamine (Invitrogen) als transfectiereagens.
- Voor het kiezen van de optimale transfectie voorwaarden tel de cellen getransfecteerd met Eg5 esiRNAs dat een mitotische arrestatie (ronde vorm) en het totale aantal cellen getransfecteerd met renilla-luciferase (RLUC) esiRNA met lichtmicroscopie show. Kies de conditie met de minste toxiciteit voor RLUC en de meest uitgesproken fenotype voor Eg5.
Een alternatieve methode voor het optimaliseren van transfectie omstandigheden gaat om een stabiele cellijn die EGFP (of een ander geschikt reportergen) onder de controle van een constitutieve actieve promotor. Na transfectie van een esiRNA tegen EGFP (of een ander reportergen) en RLUC (of een ander geschikt negatieve controle esiRNA) te meten knock-down werkzaamheid en de toxiciteit door bijvoorbeeld fluorescentie bijgestaan celsortering (FACS). Zorg ervoor dat de gebruikte esiRNA voor EGFP is volledig complementair aan het doel-mRNA.
3. Instellen van de primaire scherm 5,6
- Optimaliseer de pipetteren nauwkeurigheid voor alle gebruikte componenten op een geautomatiseerde pipetteren station (bijvoorbeeld Aquarius, Tecan en WellMate, Matrix). Omdat pipetteren parameters te wijzigen afhankelijk van het type van de oplossing, het volume en de plaat het type deze optimalisatie moet worden herhaald voor elke stap afzonderlijk. Indien mogelijk, moet het pipetteren station worden geplaatst onder een laminaire stroming kap verontreinigingen te voorkomen. Alle gebruikte onderdelen moeten worden opgeschoond voor gebruik hetzij door autoclaveren indien van toepassing of door te besproeien met 75% ethanol. Optimaliseer wash-protocollen, zodat kruisbesmetting van goed tot goed is uitgesloten. Details voor het optimaliseren van geautomatiseerde pipetteren kan niet worden geven voor de ruimte-beperkingen en grotendeels op de gebruikte pipetteren station hangen. Voor verdere informatie wordt verwezen naar de fabrikanten protocol.
- Transfecteren cellen in 384-wells formaat met behulp van de geoptimaliseerde omstandigheden van boven met esiRNAs voor Eg5 en RLUC. Gebruik een afwisselend patroon voor Eg5 en RLUC esiRNA voor de hele plaat.
- Na incubatie gedurende 48 uur de cellen herstellen met koude 100% ethanol, hydrateren in PBS gedurende 15 minuten, vlek 25 minuten in PBS met 1 ug / ml DAPI en 100 ug / ml RNase A (Qiagen). Tenslotte wassen met PBS en bewaar bij 4 ° C.
- Meten de intensiteit van de DAPI-fluorescentie microscopie door bijvoorbeeld op een Olympus ScanR systeem. Het genereren van een histogram door het plotten DAPI intensiteit tegen het aantal cellen en evalueren van de celcyclus verdeling door de berekening van het percentage cellen met het DNA-gehalte 2N voor de G1-fase; <2N> 4N voor de S-fase, 4N voor G2/M-phase en > 4N voor aneuploïdie / polyploïdie.
- Evalueer de homogeniteit van de resultaten over het bord. Verdere optimalisatie is nodig als de resultaten significant verschillen naar positie effe uit te sluitencts. Een veel voorkomend probleem bij het gebruik van multi-well platen wordt versterkt verdamping aan de rand putten tijdens incubatie tijd. Dit leidt tot verschillende experimentele condities in verschillende bronnen, die vaak vertaalt zich in plaat-positie specifieke effecten. Om deze reden adviseren wij om alle rand putten leeg voor een scherm te verlaten. Om verder te minimaliseren verdamping te zorgen dat de couveuses worden gehouden bij hoge luchtvochtigheid. We hebben ook regelmatig dienst verdamping barrières zoals Corning ademend Sealing Tape die verdamping te blokkeren. Ook andere middelen voor positie-effecten moeten worden gehouden, bv. technische variant van de uitlezing systeem (microscoop, plaat lezer, enz.) of variaties in de liquid handling (hellingen, inhomogeniteit van oplossingen, enz.).
- De statistische verschillen tussen de positieve en negatieve controles een maat voor de betekenis van de gebruikte test. Een groot verschil tussen de negatieve controle (of achtergrond lawaai; mock-control) en monster moet worden vastgesteld voordat de eigenlijke screening. Een goede maat voor de statistische significantie is de Z-factor. De Z-factor wordt berekend volgens de formule:
Z = 1 - (3 SD [voorbeeld] + 3 SD [mock]) * (| Av [voorbeeld] - Av [mock] |) -1; met SD: standaarddeviatie; Av: gemiddeld. Een Z-factor van 1> Z> 0,5 wijst op een statistisch significante scheiding van negatieve controles (en geluid) van de positieve controles 7.
4. Primaire scherm
- Bereid 384-well kultuur platen voor transfectie van esiRNAs gebruik te maken van de optimale condities van boven. Hier gebruiken we 15ng esiRNA per goed opgelost in 5μl TE-buffer. Ten minste acht controle posities per plaat dient te worden geladen met de juiste positieve en negatieve controles voor de bestudeerde biologische proces (hier: Eg5 en RLUC). Om te voorkomen dat positie-effecten de rand putten worden geladen met 5μl TE-buffer alleen.
- Voeg 5μl OptiMEM (Invitrogen) met 0.2μl Oligofectamine per goed, meng en incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.
- Voeg celsuspensie op de transfectie-mengsel (hier: 40μl van een HeLa celsuspensie bij 25 cellen / ul concentratie, overeenkomend met 1000 cellen per well) en incubeer gedurende 72 uur.
- Meet DNA-inhoud op een geautomatiseerde microscoop (Olympus ScanR, zie boven). Evalueer met behulp van Z-score statistieken voor hit selectie: Z-scores zijn berekend voor alle monster esiRNAs met behulp van het signaal voor de negatieve controle als referentie. Let op, de Z-score is niet hetzelfde als de Z-factor. Z-scores geven een statistische maat voor de significantie van het monster waarden in vergelijking met een (schijn-) controle. Het is berekend volgens de formule:
Z = (waarde [Sample] - gemiddelde [mock]) * standaard-deviatie [mock] -1.
Voor de hit selectie een drempel moet worden toegepast. Typisch, een betekenis criteria zoals: 2 <Z <-2 is gebruikt, maar afhankelijk van de kwaliteit van de dataset, de bestudeerde biologische proces of simpelweg de omvang van het scherm, verschillende drempels van toepassing kan zijn. Naast de vrij gemakkelijk Z-score statistieken ook meer uitgebreide wiskundige evaluatie methoden kunnen worden gebruikt (een eerste binnen in het brede gebied van de statistische evaluatie van de screening gegevens zijn te vinden in Malo et al.. 8).
5. Tweede scherm en druk op validatie
- Een tweede scherm volgt de primaire scherm om valse positieven te wijten aan experimentele fouten of off-target effecten te elimineren. Voor de geselecteerde raakt dezelfde procedure als die bij de eerste scherm moet worden herhaald voor een groter aantal herhalingen (3-5) tot een betere statistische evaluatie mogelijk te maken.
- Voor geverifieerd raakt een secundair niet-overlappende esiRNA (of een andere niet-overlappende silencing trigger) ten opzichte van de doelstellingen die in de eerste schermen worden gebruikt. Dezelfde test en lees-out moet worden toegepast als voor de primaire scherm.
- Uiteindelijk is de geselecteerde genen kunnen worden gevalideerd door cross-soort RNAi te redden 9. Daardoor een bacteriële kunstmatig chromosoom (BAC) codering bijvoorbeeld de muis ortholog van het gen is stabiel getransfecteerd in cellen. BAC-construeert het behoud van een gen in zijn genoom context en zorgen voor een bijna-fysiologische expressie. RNAi tegen de endogeen humaan gen zal verlaten met de muis transgenexpressie onveranderd waarin de RNAi-fenotype reddingen. RNAi-rescue levert de gouden standaard voor de controle van RNAi fenotypes beschikbaar zijn tot op heden.
- Ten slotte worden de gevalideerde kandidaten in meer detail bestudeerd om uiteindelijk leiden mechanistisch begrip. In vele gevallen RNAi kan worden gebruikt in deze experimenten, bijvoorbeeld in het voortgezet, meer uitgebreide testen.
Discussion
RNA-interferentie is uitgegroeid tot een standaard techniek om het verlies-van-functie fenotypes bestuderen. Grootschalige collecties van RNAi-mediators zijn verkrijgbaar bij verschillende leveranciers en bieden een eenvoudige, kosteneffectieve en snelle methode voor het gen-silencing. Dit opende de poort voor de systematische screening voor key-spelers in veel biologische processen waarmee een genoom-schaal perspectief op een breed scala van verschillende soorten en celtypes.
Hoge vals positieve en vals negatieve tarieven zijn een gemeenschappelijke uitdaging in RNAi schermen. Om dit probleem, zijn aanzienlijke inspanningen geïnvesteerd om de werkzaamheid te verbeteren en in het bijzonder de specificiteit van het zwijgen triggers. Een belangrijke ontdekking was dat een pool van verschillende siRNA's gericht op dezelfde doelgroep specificiteit transcript sterk verbetert. Omdat een zeer complexe pool van verschillende siRNA's wordt geproduceerd door de endoribonuclease, esiRNAs hoog doelwit specificiteit triggers, het verminderen van de vals-positieve tarief in RNAi schermen. esiRNAs hebben ook aangetoond dat een efficiënte knockdowns te bereiken, waardoor ook de valse negatieve rente.
Omdat de RNAi-schermen zijn technisch veeleisend, zullen ze waarschijnlijk blijft een uitdaging om uit te voeren op een routine-basis voor bepaalde tijd. Echter, zoals reagentia en-instrumenten beter en meer laboratoria delen hun expertise, is het gebruik van RNAi-schermen in de moderne biologie geacht te verhogen in de toekomst.
Disclosures
Auteurs verklaren de financiële relaties met commerciële entiteiten die een interesse in het ingezonden werk zou kunnen hebben.
Acknowledgments
We willen graag de leden van de Buchholz laboratorium en de Sigma-Aldrich RNAi-team te erkennen voor discussie. We willen graag het Max Planck Instituut en het Bundesministerium für Bildung und Forschung grands Go-Bio [0315105] voor support bedanken.
MISSIE ® is een geregistreerd handelsmerk van Sigma-Aldrich Biotechnologie LP
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MISSION esiRNA | Sigma-Aldrich | For additional information contact: rnai@sial.com | |
| Wellmate | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| Breathable sealing tape | Corning | Breathable Sealing Tape, Sterile (Product #3345) | |
| OptiMEM | Invitrogen | ||
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | 200 proof (absolute), for molecular biology |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P5493 | BioReagent, 10x concentrate, suitable for cell culture, for molecular biology |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Sigma-Aldrich | D8417 | Poweder, BioReagent, suitable for cell culture, >98% (HPLC and TLC) |
| Ribonuclease A from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | R6513 | For molecular biology, ≥70 Kunitz units/mg protein, lyophilized powder |
| Tris-EDTA buffer solution | Sigma-Aldrich | T9285 | 100 x, for molecular biology |
References
- Ghildiyal, M., Zamore, P. D. Small silencing RNAs: an expanding universe. Nat Rev Genet. 10, 94-108 (2009).
- Jackson, A. L. Expression profiling reveals off-target gene regulation by RNAi. Nat Biotechnol. 21, 635-637 (2003).
- Echeverri, C. J. Minimizing the risk of reporting false positives in large-scale RNAi screens. Nat Methods. 3, 777-779 (2006).
- Henschel, A., Buchholz, F., Habermann, B. DEQOR: a web-based tool for the design and quality control of siRNAs. Nucleic Acids Res. 32, W113-W120 (2004).
- Kittler, R., Pelletier, L., Buchholz, F. Systems biology of mammalian cell division. Cell Cycle. 7, 2123-2128 (2008).
- Kittler, R. Genome-scale RNAi profiling of cell division in human tissue culture cells. Nat Cell Biol. 9, 1401-1412 (2007).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J Biomol Screen. 4, 67-73 (1999).
- Malo, N., Hanley, J. A., Cerquozzi, S., Pelletier, J., Nadon, R. Statistical practice in high-throughput screening data analysis. Nat Biotechnol. 24, 167-175 (2006).
- Kittler, R. RNA interference rescue by bacterial artificial chromosome transgenesis in mammalian tissue culture cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 2396-2401 (2005).
- Kittler, R. Genome-wide resources for endoribonuclease-prepared short interfering RNAs for specific loss-of-function studies. Nat Methods. 4, 337-344 (2007).
