Summary
Ici, nous utilisons une bibliothèque esiRNA homme dans un écran à haut débit pour les gènes impliqués dans la division cellulaire. Nous démontrons comment mettre en place et mener une esiRNA écrans, ainsi que la façon d'analyser et de valider les résultats.
Abstract
L'interférence ARN (ARNi) est un mécanisme cellulaire de base pour le contrôle de l'expression génique. L'ARNi est induit par courts ARNs double brin également connu comme les petits ARN interférents (siRNA). Les courts ARN double-brin proviennent de plus à double brin par des précurseurs de l'activité de Dicer, une protéine de la famille des RNases III de endonucléases. Les fragments résultants sont des composantes du complexe ARN-induite taire (RISC), il dirige à l'ARNm cible apparenté. RISC clive l'ARNm cible réduisant ainsi l'expression de la protéine codée 1,2,3. L'ARNi est devenue une méthode puissante et largement utilisée expérimentale pour la perte d'études fonction des gènes dans les cellules de mammifères en utilisant de petits ARN interférents.
Actuellement, deux méthodes principales sont disponibles pour la production de petits ARN interférents. Une méthode consiste à la synthèse chimique, tandis qu'une autre méthode emploie un clivage endonucléolytique des cibles spécifiques à long ARN double brin par la RNase III in vitro. Ainsi, un bassin diversifié de siRNA-comme oligonucléotides est produit qui est également connu comme endoribonucléase préparés siRNA ou esiRNA. Une comparaison de l'efficacité de siRNA chimiquement dérivées et esiRNAs montre que les deux déclencheurs sont puissants dans gène cible au silence. Les différences peuvent cependant être vu quand on compare la spécificité. Beaucoup seule siRNA synthétisés chimiquement produisent éminents effets hors-cible, tandis que le mélange complexe inhérente à esiRNAs conduit à un effet de choc plus spécifiques 10.
Dans cette étude, nous présentons la conception de l'échelle du génome bibliothèques esiRNA MISSION et son utilisation pour le dépistage RNAi illustrée par un écran d'ADN contenu pour l'identification des gènes impliqués dans la progression du cycle cellulaire. Nous montrons comment optimiser le protocole de transfection et le test de dépistage dans le haut débit. Nous avons également démontrer comment de grandes séries de données peuvent être évaluées statistiquement et présenter des méthodes pour valider frappe primaire. Enfin, nous donnons potentiels points de départ pour d'autres caractérisations fonctionnelles des hits validés.
Protocol
1. Haute qualité des bibliothèques esiRNA MISSION
- Pour chaque gène d'intérêt de la région cible la plus sensible et spécifique pour l'ARNi est choisi en utilisant l'algorithme DEQOR (http://cluster-1.mpi-cbg.de/Deqor/deqor.html) 4. Scores DEQOR le potentiel de tous les faire taire 21 nucléotides possibles siRNA longtemps dans une cible basée sur l'ARNm état de l'art design 4-contraintes. En outre, chaque siARN potentiel est analysé pour d'éventuelles réactions croisées avec d'autres gènes en effectuant une recherche BLAST contre le transcriptome de l'organisme étudié. Le programme fournit ainsi une analyse de la qualité globale et transversale de silençage capacités des esiRNA potentiels (300-600 longueur pb).
- La région choisie du gène cible d'ADNc est amplifié par PCR en utilisant des amorces spécifiques de gènes flanqués de bactériophages ARN-polymérase-promoteur séquences.
- Chaque produit de PCR utilisées pour la production esiRNA MISSION est vérifié pour l'identité par séquençage et de la pureté par Caliper LabChip analyse.
- Longue ARN double brin sont transcrits à partir du produit de PCR par l'ARN polymérase, suivie d'un recuit des brins transcrits.
- esiRNAs sont préparés par digestion enzymatique limitée de la longue ARN double brin à l'aide RNaseIII suivie d'une purification par chromatographie échangeuse d'anions en utilisant colonnes de centrifugation Q-sépharose.
- esiRNAs sont précipités et remis en suspension dans du tampon TE. Le rendement est mesuré par absorption UV des mesures et la concentration est ajustée par dissolution dans un volume approprié de tampon TE. La qualité globale du produit final est contrôlé par Caliper LabChip analyse.
2. Choisir une lignée cellulaire et l'optimisation de la transfection pour le dépistage
- Titrer quantités d'esiRNA (utilisation Eg5 comme positive et Renilla-luciférase comme témoin négatif) et l'augmentation des quantités de réactifs de transfection dans une plaque de 384 puits, ajouter des cellules et incuber pendant 48 heures. Eg5 est une protéine motrice kinésine nécessaire à l'assemblage du fuseau bipolaire et l'épuisement conduit à un arrêt de la mitose. Répétez cette procédure pour différents réactifs de transfection et les lignées cellulaires. Ici, nous utilisons des cellules HeLa cultivées en suivant les procédures standard et oligofectamine (Invitrogen) comme réactif de transfection.
- Pour choisir les conditions optimales de transfection compter les cellules transfectées avec Eg5 esiRNAs qui montrent un arrêt de la mitose (forme ronde) et le nombre total de cellules transfectées avec Renilla-luciférase (Rluc) esiRNA par microscopie optique. Choisissez la condition avec le moins de toxicité pour Rluc et le phénotype le plus prononcé pour les Eg5.
Une méthode alternative pour l'optimisation des conditions de transfection implique une lignée cellulaire stable exprimant l'EGFP (ou un autre gène rapporteur approprié) sous le contrôle d'un promoteur constitutif actif. Après transfection d'un esiRNA contre EGFP (ou un autre gène rapporteur) et Rluc (ou un autre contrôle approprié esiRNA négatif) de mesurer le knock-down efficacité et la toxicité, par exemple par tri cellulaire par fluorescence assistée (FACS). Assurez-vous que le esiRNA utilisé pour EGFP est parfaitement complémentaire de la cible d'ARNm.
3. Configuration de l'écran primaire 5,6
- Optimiser la précision de pipetage pour tous les composants utilisés sur une station de pipetage automatique (par exemple, le Verseau, Tecan et WellMate, Matrix). Parce que les paramètres de pipetage changer selon le type de type de solution, le volume et la plaque de cette optimisation doit être répétée pour chaque étape séparément. Si possible, la station de pipetage doit être placé sous une hotte à flux laminaire pour éviter les contaminations. Tous les composants utilisés doivent être désinfectés avant usage, soit par autoclavage le cas échéant, ou par pulvérisation avec de l'éthanol à 75%. Optimiser les protocoles de lavage de telle sorte que la contamination croisée du puits à bien exclu. Détails pour l'optimisation de pipetage automatique ne peut pas être donner de l'espace-contraintes et dépendent largement de la station de pipetage utilisée. Pour plus d'informations reportez-vous à la fabrique du protocole.
- Cellules Transfecter en format de 384 puits en utilisant les conditions optimisées d'en haut avec esiRNAs d'Eg5 et Rluc. Utiliser un modèle alternatif pour Eg5 et Rluc esiRNA couvrant toute la plaque.
- Après une incubation de 48 heures fixer les cellules avec de l'éthanol 100% froid, réhydrater dans du PBS pendant 15 minutes, une teinture pendant 25 minutes dans du PBS contenant 1 ug / ml DAPI et 100 pg / ml de RNase A (Qiagen). Enfin laver avec du PBS et stocker à 4 ° C.
- Mesure de l'intensité de fluorescence DAPI-par exemple par la microscopie sur un système Olympus scanR. Générer un histogramme en traçant l'intensité DAPI contre le nombre de cellules et d'évaluer la distribution du cycle cellulaire en calculant le pourcentage de cellules avec l'ADN contenu 2N pour G1-phase; <2N> 4N pour la phase S; 4N pour G2/M-phase et > 4N de l'aneuploïdie / polyploïdie.
- Evaluer l'homogénéité des résultats sur la plaque. Une optimisation plus poussée est nécessaire si les résultats diffèrent de façon significative la position d'exclure EFFEcts. Un problème commun lors de l'utilisation plaques multi-puits est l'évaporation accrue au niveau des puits bord pendant la durée d'incubation. Cela conduit à différentes conditions expérimentales dans différents puits, qui se traduit souvent par la plaque-position des effets spécifiques. Pour cette raison, nous recommandons de laisser tous les puits vides bord d'un écran. Pour réduire davantage l'évaporation de s'assurer que les incubateurs sont maintenus à une humidité élevée. Nous avons également régulièrement emploient des obstacles tels que l'évaporation de bandes d'étanchéité Corning respirant qui bloque l'évaporation. Aussi les ressources d'autres effets de position doivent être pris en considération, par exemple, la variation technique du système de lecture (microscope, un lecteur de plaques, etc) ou des variations dans la manipulation de liquides (gradients, inhomogénéité de solutions, etc.)
- Les différences statistiques entre les contrôles positifs et négatifs de fournir une mesure de l'importance du test employé. Une grande différence entre le contrôle négatif (ou bruit de fond; maquette de contrôle) et l'échantillon doit être établie avant de commencer le dépistage du réel. Une bonne mesure de la signification statistique est le facteur Z. Le facteur Z est calculé selon l'équation:
Z = 1 - (3 SD [échantillon] + 3 SD [maquette]) * (| Av. [échantillon] - Av. [maquette] |) -1; avec SD: déviation standard; Av.: moyenne. Un facteur Z de 1> Z> 0,5 indique une séparation significative des contrôles négatifs (et le bruit) des contrôles positifs 7.
4. L'écran principal
- Préparer plaques 384 puits de culture tissulaire pour la transfection des esiRNAs utilisant les conditions optimisées par le haut. Ici, nous utilisons esiRNA 15ng par puits dissous dans un tampon TE 5uL. Au moins huit postes de contrôle par plaque doit être chargé avec adaptés contrôles positifs et négatifs pour le processus biologique étudié (ici: Eg5 et Rluc). Pour éviter les effets de position des puits bord sont chargés avec 5uL tampon TE seulement.
- Ajouter 5uL OptiMEM (Invitrogen) contenant Oligofectamine 0.2μl par puits, mélanger et laisser incuber pendant 20 minutes à température ambiante.
- Ajouter suspension cellulaire sur le mélange de transfection (ici: 40μl d'une suspension de cellules HeLa à 25 cellules / ul de concentration; équivalent à 1000 cellules par puits) et incuber pendant 72 heures.
- Mesurer l'ADN contenu sur un microscope automatisé (Olympus scanR, voir ci-dessus). Évaluer à l'aide du Z-score de statistiques pour la sélection de hit: Z-scores sont calculés pour l'ensemble de l'échantillon esiRNAs utilisant le signal pour le contrôle négatif comme référence. Remarque, le Z-score n'est pas le même que le Z-facteur. Z-scores de fournir une mesure statistique pour la signification des valeurs de l'échantillon en comparaison à un contrôle (maquette). Elle est calculée suivant l'équation:
Z = (valeur [Exemple] - moyenne [maquette]) * écart-type [maquette] -1.
Pour la sélection touché un seuil doit être appliquée. Typiquement, un critère d'importance comme: 2 <Z <-2 est utilisé, mais en fonction de la qualité des données, le processus biologique étudié ou simplement la portée de l'écran, différents seuils peuvent être applicables. A côté de la assez facile Z-score statistiques font également plus élaborées des méthodes d'évaluation mathématiques peuvent être utilisées (une première dans l'intérieur du vaste champ de l'évaluation statistique des données du dépistage peuvent être trouvés dans Malo et al. 8).
5. L'écran secondaire et la validation frappé
- Un écran secondaire suit l'écran principal d'éliminer les faux positifs dus à des erreurs expérimentales ou effets hors-cible. Pour les hits choisis la même procédure utilisée dans l'écran principal devrait être répétée pour un plus grand nombre de répétitions (3-5) pour permettre une meilleure évaluation statistique.
- Pour frappe vérifié un esiRNA secondaire non-cumul (ou un autre déclencheur taire non-cumul) à l'encontre des objectifs identifiés dans les écrans initiale devrait être utilisée. Le même dosage et la lecture doit être appliqué que pour l'écran principal.
- Finalement, les gènes sélectionnés peuvent être validées par inter-espèces de secours ARNi 9. Ainsi un chromosome bactérien artificiel (BAC) d'encodage par exemple l'orthologue de la souris du gène est transfectées de façon stable dans les cellules. BAC-construit de préserver un gène dans son contexte génomique et de permettre une expression quasi-physiologiques. ARNi contre le gène endogène humain va quitter l'expression du transgène de souris inaltéré qui sauve le RNAi-phénotype. ARNi de sauvetage fournit l'étalon-or pour la vérification des phénotypes ARNi disponibles à ce jour.
- Enfin, les candidats validés sont étudiés plus en détail pour éventuellement tirer compréhension mécaniste. Dans de nombreux cas l'ARNi peut être utilisée dans ces expériences, par exemple dans le secondaire, les tests plus élaborés.
Discussion
Interférence ARN est devenue une technique standard pour étudier la perte de fonction des phénotypes. À grande échelle des collections de l'ARNi médiateurs sont disponibles auprès de différents fournisseurs et de fournir une méthode simple, efficace et rapide pour le gène de silençage. Cela a ouvert la porte pour le dépistage systématique des acteurs-clés dans de nombreux processus biologiques permettant une perspective échelle du génome sur un large éventail d'espèces différentes et de types cellulaires.
Taux élevé de faux positifs et de faux négatifs sont un défi commun dans les écrans de l'ARNi. Pour résoudre ce problème, des efforts considérables ont été investis pour améliorer l'efficacité et en particulier de la spécificité de la réduction au silence des déclencheurs. Une découverte importante est que d'une piscine de siRNA ciblant différents la même transcription améliore considérablement la spécificité cible. Parce que d'une piscine très complexe de siRNA différent est produit par le endoribonucléase, esiRNAs sont élevés déclenche une spécificité de ciblage, réduire le taux de faux positifs dans les écrans de l'ARNi. esiRNAs ont également démontré pour atteindre passes rabattues efficace, de réduire également le taux de faux négatifs.
Parce écrans ARNi sont techniquement exigeants, ils vont probablement rester difficiles à réaliser sur une base régulière pendant un certain temps. Cependant, comme les réactifs et les instruments se laboratoires mieux et plus partager leur expertise, l'utilisation d'écrans ARNi dans la biologie moderne sont réputés pour augmenter à l'avenir.
Disclosures
Auteurs de déclarer des relations financières avec des entités commerciales qui pourraient avoir un intérêt dans le travail présenté.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier les membres du laboratoire Buchholz et le Sigma-Aldrich ARNi équipe pour la discussion. Nous tenons à remercier la Société Max Planck et le Bundesministerium für Bildung und Forschung Grands Allez-Bio [0315105] pour le soutien.
MISSION ® est une marque déposée de Sigma-Aldrich Biotechnology LP
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MISSION esiRNA | Sigma-Aldrich | For additional information contact: rnai@sial.com | |
| Wellmate | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| Breathable sealing tape | Corning | Breathable Sealing Tape, Sterile (Product #3345) | |
| OptiMEM | Invitrogen | ||
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | 200 proof (absolute), for molecular biology |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P5493 | BioReagent, 10x concentrate, suitable for cell culture, for molecular biology |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Sigma-Aldrich | D8417 | Poweder, BioReagent, suitable for cell culture, >98% (HPLC and TLC) |
| Ribonuclease A from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | R6513 | For molecular biology, ≥70 Kunitz units/mg protein, lyophilized powder |
| Tris-EDTA buffer solution | Sigma-Aldrich | T9285 | 100 x, for molecular biology |
References
- Ghildiyal, M., Zamore, P. D. Small silencing RNAs: an expanding universe. Nat Rev Genet. 10, 94-108 (2009).
- Jackson, A. L. Expression profiling reveals off-target gene regulation by RNAi. Nat Biotechnol. 21, 635-637 (2003).
- Echeverri, C. J. Minimizing the risk of reporting false positives in large-scale RNAi screens. Nat Methods. 3, 777-779 (2006).
- Henschel, A., Buchholz, F., Habermann, B. DEQOR: a web-based tool for the design and quality control of siRNAs. Nucleic Acids Res. 32, W113-W120 (2004).
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- Kittler, R. Genome-wide resources for endoribonuclease-prepared short interfering RNAs for specific loss-of-function studies. Nat Methods. 4, 337-344 (2007).
