Summary
כאן אנו להשתמש בספריית esiRNA האדם המסך תפוקה גבוהה עבור גנים המעורבים חלוקת התא. אנו מדגימים כיצד להקים ולנהל מסכי esiRNA, וכן כיצד לנתח ולאמת את התוצאות.
Abstract
התערבות RNA (RNAi) הוא מנגנון בסיסי הסלולר לבקרה של ביטוי גנים. RNAi הוא המושרה על ידי פעמיים תקועים RNAs קצר הידוע גם בשם RNAs התערבות קטנה (siRNAs). קצר פעמיים תקועים RNAs מקורן יותר מבשרי גדילי כפול על ידי פעילות של דייסר, חלבון ממשפחת RNase III של endonucleases. שברי וכתוצאה מכך הם מרכיבים של RNA-Induced השתקה מורכבות (RISC), בהכוונת אותו mRNA המטרה מאותו מקור. RISC cleaves את ה-mRNA היעד ובכך להפחית את הביטוי של החלבון המקודד 1,2,3. RNAi הפכה שיטה ניסיונית עוצמה בשימוש נרחב עבור אובדן של מחקרים לתפקד גנים בתאי יונקים ניצול RNAs התערבות קטנה.
כיום שתי שיטות עיקריות זמינים לייצור RNAs התערבות קטנה. שיטה אחת כרוכה סינתזה כימית, ואילו שיטה חלופית מעסיקה מחשוף endonucleolytic של יעד ספציפי פעמיים תקועים RNAs ארוך על ידי RNase III במבחנה. ובכך, בריכה מגוונת של siRNA כמו oligonucleotides מיוצר אשר ידוע גם בשם-siRNA endoribonuclease מוכן או esiRNA. השוואה של היעילות של siRNAs ו esiRNAs נגזרת כימית מראה מעורר הן עוצמה והשתקת מטרה גן. הבדלים עם זאת, ניתן לראות כאשר משווים סגוליות. רבים siRNAs מסונתז כימי יחיד לייצר בולטות מחוץ היעד תופעות, ואילו תערובת מורכבת הטמון esiRNAs מוביל מציאה ספציפי יותר 10.
במחקר זה, אנו מציגים את העיצוב של הגנום בקנה מידה esiRNA ספריות המשימה וניצול שלו להקרנה RNAi לידי ביטוי במסך ה-DNA תוכן לזיהוי גנים המעורבים התקדמות מחזור התא. אנחנו מראים איך לייעל את פרוטוקול transfection ואת assay להקרנה של תפוקה גבוהה. אנחנו גם מדגימים כיצד נתונים גדולים מגדיר ניתן להעריך סטטיסטית ולהציג שיטות לאימות להיטים העיקרי. לבסוף, אנחנו נותנים נקודות מוצא פוטנציאל אפיונים תפקודית נוספת של להיטים תוקף.
Protocol
1. באיכות גבוהה esiRNA המשימה ספריות
- עבור כל עניין הגן לאזור המיקוד רגישים ביותר ספציפית עבור RNAi נבחר ניצול אלגוריתם DEQOR (http://cluster-1.mpi-cbg.de/Deqor/deqor.html). 4 ציונים DEQOR את הפוטנציאל ההשתקה של כל אפשרי 21 נוקלאוטידים siRNAs ארוכה mRNA-היעד המבוסס על המדינה-of-the-art עיצוב אילוצים 4. בנוסף, siRNA כל הפוטנציאל הוא ניתח עבור תגובתיות צולבת אפשרי עם גנים אחרים על ידי ביצוע חיפוש תפציץ נגד transcriptome האורגניזם למד. התוכנית ובכך מספק ניתוח של איכות הכוללת בין היכולות של השתקה esiRNA את הפוטנציאל (300-600 אורך נ"ב).
- האזור הנבחר של גנים היעד cDNA מוגבר על ידי ה-PCR באמצעות גן ספציפי primers מוקף bacteriophage RNA-פולימראז-האמרגן רצפים.
- כל מוצר PCR המשמש לייצור esiRNA המשימה מאומתת זהות על ידי רצף של טוהר על ידי ניתוח Labchip Caliper.
- לונג פעמיים תקועים RNA הוא עיבד מ-PCR המוצר על ידי RNA פולימראז, ואחריו חישול של גדילי עיבד.
- esiRNAs מוכנים על ידי עיכול אנזימטי מוגבל של פעמיים תקועים רנ"א ארוך באמצעות RNaseIII ואחריו טיהור באמצעות כרומטוגרפיה אניון מטבע ניצול Q-sepharose עמודות ספין.
- esiRNAs הם זירז ו resuspended במאגר TE. התשואה נמדדת UV-קליטת מדידות ריכוז מותאם ידי המסת בכרך המתאים של חיץ TE. האיכות הכוללת של המוצר הסופי נבדק על ידי ניתוח Labchip Caliper.
2. בחירת שורת תאים ואופטימיזציה transfection להקרנה
- כמויות לכיל של esiRNA (שימוש Eg5 כמו חיוביים renilla-בלוציפראז כביקורת שלילית) והגדלת סכומי מגיב transfection בצלחת 384 היטב, מוסיפים תאים דגירה של 48 שעות. Eg5 הוא חלבון מנוע kinesin נדרש הרכבה ציר דו קוטבית דלדול מוביל לעצור mitotic. חזור על הליך זה עבור ריאגנטים transfection שונים שורות תאים. כאן, אנו משתמשים בתאים בתרבית הלה בעקבות הליכים סטנדרטיים oligofectamine (Invitrogen) כמו מגיב transfection.
- לבחירת תנאים אופטימליים transfection לספור את התאים transfected עם Eg5 esiRNAs להראות כי מעצר mitotic (צורה עגולה) ואת המספר הכולל של תאים transfected עם esiRNA (RLUC) renilla-בלוציפראז על ידי מיקרוסקופ אור. בחר את המצב עם רעילות לפחות RLUC ואת הפנוטיפ בולט ביותר Eg5.
שיטה חלופית לייעול התנאים transfection כוללת שורת תאים יציבה מביע EGFP (או גן אחר כתב מתאים) תחת שליטה של מקדם פעיל מכוננת. לאחר transfection של esiRNA נגד EGFP (או גן אחר כתב) ו RLUC (או אחרת esiRNA מתאים לשלוט שלילי) לדפוק למטה למדוד יעילות ורעילות על ידי מיון התא הקרינה למשל סייעה (FACS). ודא esiRNA המשמש EGFP הוא משלים לחלוטין-mRNA המטרה.
3. הגדרת את המסך ראשי 5,6
- מטב את הדיוק pipetting עבור כל הרכיבים המשמשים בתחנת pipetting אוטומטיות (למשל אקווריוס, טקאן WellMate, מטריקס). בגלל הפרמטרים pipetting לשנות בהתאם לסוג סוג, פתרון נפח צלחת אופטימיזציה זה יש צורך לחזור על כל שלב בנפרד. אם אפשר, תחנת pipetting צריך להיות ממוקם מתחת למכסה המנוע זרימה למינרית כדי למנוע זיהומים. כל הרכיבים המשמשים צריך להיות מחוטא לפני השימוש או על ידי מעוקר אם ישים או על ידי ריסוס עם אתנול 75%. מטב לשטוף פרוטוקולים כך צולבות זיהום היטב גם היא מחוץ לתחום. פרטים עבור אופטימיזציה של pipetting אוטומטיות לא ניתן לתת תמורת אילוצי מרחב תלויות במידה רבה התחנה pipetting מנוצל. לפרטים נוספים עיין בפרוטוקול מייצרת.
- תאים Transfect בפורמט 384 גם באמצעות תנאי אופטימיזציה מלמעלה עם esiRNAs עבור Eg5 ו RLUC. השתמש דפוס לסירוגין במשך Eg5 ו RLUC esiRNA מכסה את הצלחת כולה.
- לאחר הדגרה למשך 48 שעות לתקן את התאים עם 100% אתנול קר, רעננותם ב PBS במשך 15 דקות, כתם במשך 25 דקות ב PBS המכיל 1 מיקרוגרם / מ"ל ו - 100 מיקרוגרם DAPI / ml RNase (Qiagen). לבסוף לשטוף עם PBS ולאחסן ב 4 ° C.
- מדידת עוצמת הקרינה על ידי-DAPI למשל במיקרוסקופ על מערכת אולימפוס ScanR. יצירת היסטוגרמה של עוצמת DAPI מזימות כנגד מספר התא להעריך את חלוקת מחזור התא על ידי חישוב אחוז התאים עם ה-DNA תוכן 2N עבור שלב G1; <2N> 4N עבור S-שלב; 4N עבור G2/M-phase ו > 4N עבור aneuploidy / polyploidy.
- הערכת ההומוגניות של תוצאות מעל הצלחת. אופטימיזציה נוספת נדרשת אם תוצאות שונות משמעותית להוציא effe עמדהCTS. בעיה שכיחה בעת שימוש רב גם לוחיות אידוי היא משופרת על בארות קצה בזמן הדגירה. זה מוביל תנאים ניסויים שונים בבארות שונים, אשר לעתים קרובות מתרגמת צלחת עמדה השפעות ספציפיות. מסיבה זו, אנו ממליצים להשאיר את כל בארות קצה ריק במסך. כדי לצמצם עוד יותר אידוי לוודא כי חממות נשמרים לחות גבוהה. אנחנו גם שגרתי להעסיק מחסומים אידוי כגון קלטת איטום קורנינג לנשימה אשר לחסום אידוי. משאבים אחרים גם עבור אפקטים עמדה צריך להילקח בחשבון, וריאציה טכניים כגון מערכת readout (מיקרוסקופ צלחת הקורא, וכו ') או וריאציות בטיפול נוזלי (הדרגתיים, inhomogeneity של פתרונות, וכו').
- הבדלים סטטיסטיים בין בקרות חיוביות ושליליות לספק למדוד את המשמעות של assay מועסק. הבדל גדול בין שליטה שלילי (או רעשי רקע, שליטה מדומה) לבין המדגם צריך להיות הוקמה לפני תחילת ההקרנה בפועל. מדד טוב עבור המשמעות הסטטיסטית היא Z-הגורם. Z-גורם מחושב המשוואה הבאה:
Z = 1 - (3 SD [מדגם] + 3 SD [מדומה]) * (| באב [מדגם] - באב [מדומה] |) -1; עם SD: סטיית התקן; באב: ממוצע. Z-פקטור של 1> Z> 0.5 מצביע על הפרדה מובהקת סטטיסטית של בקרות שלילית (רעש) מן שולטת חיוביים 7.
4. ראשי המסך
- הכן 384 גם תרבות צלחות רקמה transfection של esiRNAs ניצול התנאים אופטימיזציה מלמעלה. כאן, אנו משתמשים esiRNA 15ng מומס היטב לכל חיץ TE 5μl. לפחות שמונה עמדות בקרה לכל צלחת צריך להיות עמוסה בקרות חיוביות ושליליות מתאים לתהליך ביולוגי למד (כאן: Eg5 ו RLUC). כדי למנוע תופעות עמדה בארות קצה נטענים עם חיץ TE 5μl בלבד.
- הוסף 5μl OptiMEM (Invitrogen) המכיל Oligofectamine 0.2μl לכל היטב, לערבב דגירה במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.
- הוסף ההשעיה התא על התערובת transfection (כאן: 40μl ההשעיה תא הלה במהירות של 25 תאים / ריכוז μl, שווה ערך ל 1000 לכל התאים היטב) ו דגירה במשך 72 שעות.
- מדד ה-DNA על תוכן מיקרוסקופ אוטומטיות (אולימפוס ScanR, ראה לעיל). הערכת משתמש Z-ציון סטטיסטיקה לבחירה להכות: Z-הציונים מחושבים עבור כל esiRNAs מדגם באמצעות האות שליטה שלילי כנקודת התייחסות. שים לב, הציון-Z אינו זהה כגורם-Z. Z-עשרות לספק מידה סטטיסטית המשמעות של ערכי המדגם בהשוואה שליטה (מדומה). זה מחושב על המשוואה הבאה:
Z = (ערך [לדוגמא] - ממוצע [מדומה]) * סטיית תקן-[מדומה] -1.
עבור מבחר פגע סף צריך להיות מיושם. בדרך כלל, משמעות קריטריונים כמו: 2 <Z <-2 משמש, אבל תלוי באיכות של בסיס הנתונים, את חקר תהליך ביולוגי או פשוט היקף של המסך, ספי שונות עשויות לחול. לצד ה-Z ציון סטטיסטיקה קל למדי גם משוכלל יותר שיטות הערכה מתמטית ניתן להשתמש (בתוך הראשונה לתוך שדה רחב של הערכות סטטיסטיות של נתוני ההקרנה ניתן למצוא Malo et al. 8).
5. מסך משני ואימות פגע
- מסך משני כדלקמן המסך העיקרי לחסל חיוביות שגויות עקב שגיאות ניסיוני או מחוץ היעד תופעות. במשך להיטים שנבחרו בהליך זהה בשימוש במסך הראשי יש לחזור על מספר גדול יותר של משכפל (3-5), כדי לאפשר הערכה סטטיסטית טובה יותר.
- במשך להיטים מאומת esiRNA שאינן חופפות משני (או אחרת ההדק שאינן חופפות השתקה) נגד יעדים המזוהים המסכים הראשוני אמור לשמש. Assay אותו לקריאה החוצה צריך להיות מוחל גם על המסך הראשי.
- בסופו של דבר הגנים הנבחר יכול להיות מאומת על ידי הצלה RNAi חוצה מינים 9. ובכך כרומוזום בקטריאלי מלאכותי (BAC) קידוד למשל ortholog את העכבר של הגן הוא transfected ביציבות לתוך התאים. BAC-בונה לשמר את הגן בהקשר הגנומי שלו ולאפשר ביטוי כמעט-פיזיולוגיים. RNAi נגד הגן האנושי אנדוגני יעזוב את transgene עכבר ביטוי ללא שינוי אשר מציל RNAi-פנוטיפ. RNAi הצלה מספק זהב סטנדרטי עבור אימות של פנוטיפים RNAi זמין עד כה.
- לבסוף, המועמדים תוקף נלמדים בפירוט רב יותר בסופו של דבר לגזור הבנה מכניסטית. במקרים רבים RNAi יכול לשמש בניסויים אלה, למשל, מבחני משני משוכללים יותר.
Discussion
התערבות RNA הפך טכניקה סטנדרטיים ללמוד הפסד של פונקציה פנוטיפים. בקנה מידה גדול אוספים של RNAi-מתווכים זמינים ספקים שונים ולספק שיטה קלה, חסכונית ומהירה על השתקה של גן. זה פתח את השער להקרנה שיטתית מפתח שחקנים תהליכים ביולוגיים רבים ומאפשר פרספקטיבה הגנום בקנה מידה על מגוון רחב של מינים שונים, סוגי תאים.
שיעורי גבוהה שווא שלילי חיובי כוזב הם אתגר משותף מסכי RNAi. כדי לטפל בבעיה זו, מאמצים רבים הושקעו על מנת לשפר את היעילות בפרט הספציפיות של השתקת מפעילה. התגלית החשובה הייתה בריכה של siRNAs שונה המיקוד התמליל זהה משפר באופן משמעותי את היעד הספציפיות. מכיוון בריכת מורכבת מאוד של siRNAs שונה מופק על ידי endoribonuclease, esiRNAs גבוהים סגוליות מעורר היעד, הפחתת שיעור חיובי כוזב מסכי RNAi. esiRNAs הוכיחו גם להשיג knockdowns יעיל, גם הפחתת שיעור שלילי כוזב.
מכיוון מסכי RNAi הם תובענית מבחינה טכנית, סביר להניח שהם יישארו מאתגר לבצע על בסיס קבוע במשך זמן מה. עם זאת, כפי ריאגנטים ומכשירים מעבדות לקבל יותר ויותר לשתף את מומחיותם, השימוש במסכים RNAi בביולוגיה המודרנית נחשבים להגדיל בעתיד.
Disclosures
מחברים להכריז יחסים פיננסיים עם גופים מסחריים שאולי יש אינטרס העבודה שהוגשה.
Acknowledgments
ברצוננו להודות לחברי מעבדה בוכהולץ ואת סיגמא אולדריץ RNAi צוות לדיון. ברצוננו להודות מקס פלאנק החברה ואת für Bundesministerium Bildung und Forschung Grands Go-Bio [0315105] לתמיכה.
MISSION ® הינו סימן מסחרי רשום של סיגמא אולדריץ ביוטכנולוגיה LP
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MISSION esiRNA | Sigma-Aldrich | For additional information contact: rnai@sial.com | |
| Wellmate | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| Breathable sealing tape | Corning | Breathable Sealing Tape, Sterile (Product #3345) | |
| OptiMEM | Invitrogen | ||
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | 200 proof (absolute), for molecular biology |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P5493 | BioReagent, 10x concentrate, suitable for cell culture, for molecular biology |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Sigma-Aldrich | D8417 | Poweder, BioReagent, suitable for cell culture, >98% (HPLC and TLC) |
| Ribonuclease A from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | R6513 | For molecular biology, ≥70 Kunitz units/mg protein, lyophilized powder |
| Tris-EDTA buffer solution | Sigma-Aldrich | T9285 | 100 x, for molecular biology |
References
- Ghildiyal, M., Zamore, P. D. Small silencing RNAs: an expanding universe. Nat Rev Genet. 10, 94-108 (2009).
- Jackson, A. L. Expression profiling reveals off-target gene regulation by RNAi. Nat Biotechnol. 21, 635-637 (2003).
- Echeverri, C. J. Minimizing the risk of reporting false positives in large-scale RNAi screens. Nat Methods. 3, 777-779 (2006).
- Henschel, A., Buchholz, F., Habermann, B. DEQOR: a web-based tool for the design and quality control of siRNAs. Nucleic Acids Res. 32, W113-W120 (2004).
- Kittler, R., Pelletier, L., Buchholz, F. Systems biology of mammalian cell division. Cell Cycle. 7, 2123-2128 (2008).
- Kittler, R. Genome-scale RNAi profiling of cell division in human tissue culture cells. Nat Cell Biol. 9, 1401-1412 (2007).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J Biomol Screen. 4, 67-73 (1999).
- Malo, N., Hanley, J. A., Cerquozzi, S., Pelletier, J., Nadon, R. Statistical practice in high-throughput screening data analysis. Nat Biotechnol. 24, 167-175 (2006).
- Kittler, R. RNA interference rescue by bacterial artificial chromosome transgenesis in mammalian tissue culture cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 2396-2401 (2005).
- Kittler, R. Genome-wide resources for endoribonuclease-prepared short interfering RNAs for specific loss-of-function studies. Nat Methods. 4, 337-344 (2007).
