Summary
यहाँ हम कोशिका विभाजन में शामिल जीनों के लिए एक उच्च throughput स्क्रीन में एक मानव esiRNA लायब्रेरी का उपयोग करें. हम कैसे स्थापित करने के लिए और एक esiRNA स्क्रीन, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से विश्लेषण करने के लिए और परिणाम को मान्य करने के आचरण का प्रदर्शन.
Abstract
शाही सेना हस्तक्षेप (आरएनएआई) जीन अभिव्यक्ति के नियंत्रण के लिए एक बुनियादी सेलुलर तंत्र है. आरएनएआई कम भी छोटे दखल RNAs (siRNAs) के रूप में जाना जाता है डबल असहाय RNAs के द्वारा प्रेरित है. कम डबल असहाय RNAs अब पासा खेलनेवाला, endonucleases के RNase III परिवार के एक प्रोटीन की गतिविधि से डबल असहाय व्यापारियों से उत्पन्न. परिणामस्वरूप टुकड़े शाही सेना प्रेरित मुंह बंद जटिल (RISC) के घटक हैं, यह भाईचारे का लक्ष्य mRNA निर्देशन. RISC लक्ष्य mRNA जिससे इनकोडिंग 1,2,3 प्रोटीन की अभिव्यक्ति को कम करने cleaves. आरएनएआई जीन समारोह के अध्ययन के स्तनधारी कोशिकाओं में छोटे दखल RNAs का उपयोग नुकसान के लिए एक शक्तिशाली और व्यापक रूप से प्रयोग किया जाता प्रयोगात्मक विधि बन गया है.
वर्तमान में दो मुख्य तरीके छोटे दखल RNAs के उत्पादन के लिए उपलब्ध हैं. एक विधि रासायनिक संश्लेषण शामिल है, जबकि एक वैकल्पिक तरीका RNase क्ष्क्ष्क्ष् द्वारा इन विट्रो में लक्ष्य विशिष्ट लंबे समय डबल असहाय RNAs के endonucleolytic दरार कार्यरत हैं. इस प्रकार, siRNA तरह oligonucleotides की एक विविध पूल का उत्पादन किया है जो endoribonuclease तैयार siRNA या esiRNA के रूप में भी जाना जाता है. रासायनिक व्युत्पन्न siRNAs और esiRNAs की प्रभावकारिता की तुलना से पता चलता है कि दोनों चलाता लक्ष्य जीन मुंह बंद में शक्तिशाली हैं. अंतर, तथापि, जब विशिष्टता की तुलना कर सकते हैं देखा जा. कई एकल रासायनिक संश्लेषित siRNAs प्रमुख बंद लक्ष्य प्रभाव उत्पादन, जबकि esiRNAs में निहित जटिल मिश्रण एक अधिक विशिष्ट 10 पछाड़ना की ओर जाता है है .
इस अध्ययन में, हम जीनोम पैमाने मिशन esiRNA पुस्तकालयों और आरएनएआई स्क्रीनिंग कोशिका चक्र प्रगति में शामिल जीनों की पहचान के लिए डीएनए सामग्री स्क्रीन के द्वारा उदाहरण के लिए इसके उपयोग के डिजाइन प्रस्तुत करते हैं. हम बताते हैं कैसे अभिकर्मक प्रोटोकॉल और उच्च throughput में स्क्रीनिंग के लिए परख का अनुकूलन करने के लिए. हम भी कैसे बड़े डेटा सेट प्रदर्शित सांख्यिकीय मूल्यांकन किया जा सकता है और तरीकों को पेश करने के लिए प्राथमिक हिट मान्य है. अंत में, हम संभावित मान्य हिट के आगे कार्यात्मक characterizations के लिए शुरू अंक दे.
Protocol
1. उच्च गुणवत्ता मिशन esiRNA पुस्तकालयों
- आरएनएआई के लिए ब्याज की हर जीन के लिए सबसे अतिसंवेदनशील और विशिष्ट लक्ष्य क्षेत्र DEQOR एल्गोरिथ्म (http://cluster-1.mpi-cbg.de/Deqor/deqor.html) का उपयोग चुना है 4 DEQOR स्कोर. सभी का मुंह बंद करने की क्षमता राज्य के कला की कमी - डिजाइन 4 के आधार पर एक लक्ष्य mRNA में संभव 21 लंबे siRNAs nucleotides. इसके अलावा, प्रत्येक संभावित siRNA अन्य जीनों के साथ संभव पार जेट के लिए जीव के transcriptome के खिलाफ एक बम विस्फोट खोज अध्ययन प्रदर्शन से विश्लेषण किया है. कार्यक्रम जिससे समग्र गुणवत्ता और संभावित esiRNA (300-600 बीपी लंबाई) के पार मुंह बंद क्षमता के एक विश्लेषण प्रदान करता है.
- सीडीएनए लक्ष्य जीन की चुना क्षेत्र का उपयोग करते हुए पीसीआर जीन विशिष्ट प्राइमरों जीवाणुभोजी आरएनए पोलीमरेज़ प्रमोटर अनुक्रम द्वारा flanked से परिलक्षित होता है.
- हर पीसीआर मिशन esiRNA उत्पादन के लिए प्रयोग किया जाता उत्पाद अनुक्रमण द्वारा पहचान के लिए और पवित्रता के लिए कैलिपर Labchip विश्लेषण द्वारा सत्यापित है.
- लांग डबल असहाय आरएनए पीसीआर उत्पाद से शाही सेना पोलीमरेज़, एक लिखित strands के annealing द्वारा पीछा द्वारा लिखित है.
- esiRNAs लंबे डबल असहाय शाही सेना का उपयोग कर आयनों विनिमय क्रोमैटोग्राफी क्यू sepharose स्पिन स्तंभों का उपयोग के माध्यम से शुद्धि द्वारा पीछा RNaseIII सीमित enzymatic पाचन द्वारा तैयार कर रहे हैं.
- esiRNAs उपजी हैं और ते बफर में resuspended. उपज यूवी अवशोषण मापन के द्वारा मापा जाता है और एकाग्रता ते बफर के एक उचित मात्रा में भंग करके निकाला जाता है. अंतिम उत्पाद की समग्र गुणवत्ता कैलिपर Labchip विश्लेषण द्वारा जाँच की है.
2. एक सेल लाइन का चयन और स्क्रीनिंग के लिए अभिकर्मक के अनुकूलन
- (सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण के रूप में renilla-luciferase रूप Eg5 उपयोग) esiRNA और 384 अच्छी तरह से एक थाली में अभिकर्मक अभिकर्मक की मात्रा में वृद्धि के टाइट्रेट मात्रा, 48 घंटे के लिए और कोशिकाओं सेते जोड़ें. Eg5 एक kinesin मोटर द्विध्रुवी धुरा विधानसभा और रिक्तीकरण के लिए आवश्यक प्रोटीन है एक mitotic गिरफ्तारी के लिए होता है. अलग अभिकर्मक अभिकर्मकों और सेल लाइनों के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएँ. यहाँ, हम निम्नलिखित मानक प्रक्रिया और अभिकर्मक अभिकर्मक के रूप में oligofectamine (Invitrogen) HeLa संवर्धित कोशिकाओं का उपयोग करें.
- इष्टतम अभिकर्मक शर्तों को चुनने के लिए Eg5 esiRNAs कि एक mitotic (गोल आकार) की गिरफ्तारी और प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा renilla luciferase esiRNA (RLUC) के साथ ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं की कुल संख्या दिखाने के साथ ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं गिनती. RLUC के लिए कम से कम विषाक्तता और Eg5 के लिए सबसे स्पष्ट phenotype के साथ शर्त चुनें.
अभिकर्मक शर्तों के अनुकूलन के लिए एक वैकल्पिक तरीका एक स्थिर सेल EGFP (या किसी अन्य उपयुक्त रिपोर्टर जीन) के एक विधान सक्रिय प्रमोटर के नियंत्रण के तहत व्यक्त लाइन शामिल है. EGFP (या किसी अन्य रिपोर्टर जीन) और (या किसी अन्य उपयुक्त नकारात्मक नियंत्रण esiRNA) दस्तक नीचे उपाय जैसे प्रतिदीप्ति सहायता सेल छँटाई (FACS) द्वारा प्रभावकारिता और विषाक्तता RLUC के खिलाफ एक esiRNA के अभिकर्मक के बाद. सुनिश्चित करें कि EGFP के लिए इस्तेमाल किया esiRNA लक्ष्य mRNA के लिए पूरी तरह से पूरक है.
3. प्राथमिक स्क्रीन 5,6 स्थापना
- एक स्वचालित pipetting स्टेशन (जैसे कुंभ, Tecan और WellMate, मैट्रिक्स) पर सभी घटकों के लिए इस्तेमाल किया pipetting सटीकता ऑप्टिमाइज़. क्योंकि pipetting मापदंडों समाधान की मात्रा, और थाली प्रकार के प्रकार के आधार पर बदल अनुकूलन करने के लिए हर कदम के लिए अलग से दोहराया जा. यदि संभव हो तो, pipetting स्टेशन लामिना का प्रवाह हुड के नीचे रखा जाना चाहिए से बचने के लिए contaminations. सभी इस्तेमाल किया घटकों के उपयोग करने से पहले साफ किया जाना चाहिए या तो autoclaving यदि लागू हो या 75% इथेनॉल के साथ छिड़काव द्वारा. धोने प्रोटोकॉल ऑप्टिमाइज़ इतना है कि अच्छी तरह से पार संदूषण अच्छी तरह से बाहर रखा गया है. विवरण स्वचालित pipetting के अनुकूलन के लिए अंतरिक्ष बाधाओं के लिए देने के लिए और उपयोग pipetting स्टेशन पर काफी हद तक निर्भर नहीं किया जा सकता है. अधिक जानकारी के लिए प्रोटोकॉल बनाती देखें.
- 384 अच्छी तरह प्रारूप में transfect कोशिकाओं Eg5 और RLUC के लिए esiRNAs के साथ ऊपर से अनुकूलित शर्तों का उपयोग. Eg5 और RLUC esiRNA के लिए एक बारी पैटर्न पूरी थाली को कवर का उपयोग करें.
- के बाद 48 घंटे के लिए ऊष्मायन ठंड 100% इथेनॉल के साथ कोशिकाओं को ठीक करने के लिए, 15 मिनट के लिए पीबीएस में rehydrate, पीबीएस में 25 मिनट 1 / μg मिलीलीटर DAPI और 100 μg / एमएल RNase ए (Qiagen) युक्त के लिए दाग. अंत में 4 में पीबीएस और दुकान के साथ धो ° सी.
- एक ओलिंप ScanR प्रणाली पर माइक्रोस्कोपी जैसे द्वारा DAPI - प्रतिदीप्ति के उपाय तीव्रता. सेल नंबर के खिलाफ DAPI तीव्रता की साजिश रचने के द्वारा हिस्टोग्राम उत्पन्न और डीएनए सामग्री 2N के साथ G1 चरण के लिए कोशिकाओं का प्रतिशत की गणना के द्वारा कोशिका चक्र वितरण का मूल्यांकन; <2N> एस चरण के लिए 4N, G2/M-phase के लिए 4N और > / aneuploidy polyploidy लिए 4N.
- थाली पर परिणामों की एकरूपता का मूल्यांकन. इसके अलावा अनुकूलन की जरूरत है अगर परिणाम काफी अलग स्थिति effe बाहरcts. एक आम समस्या है जब बहु - अच्छी तरह से प्लेट का उपयोग कर ऊष्मायन समय के दौरान बढ़त कुओं पर बढ़ाया वाष्पीकरण है. यह अलग अलग कुओं, जो अक्सर थाली स्थिति विशेष प्रभाव के लिए अनुवाद में प्रयोगात्मक शर्तों की ओर जाता है है. इस कारण से, हम सभी किनारे एक स्क्रीन के लिए खाली कुओं छोड़ सलाह देते हैं. आगे वाष्पीकरण कम से कम यकीन है कि इन्क्यूबेटरों उच्च आर्द्रता में रखा जाता है. हम भी नियमित Corning सांस सील टेप है जो वाष्पीकरण ब्लॉक जैसे वाष्पीकरण बाधाओं को रोजगार. स्थिति प्रभाव के लिए इसके अलावा अन्य संसाधनों विचार readout प्रणाली के उदाहरण तकनीकी भिन्नता (माइक्रोस्कोप, पाठक थाली, आदि) या तरल से निपटने में बदलाव (gradients, समाधान, आदि के inhomogeneity) में रखा जाना है.
- सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण के बीच सांख्यिकीय अंतर कार्यरत परख के महत्व के लिए एक उपाय प्रदान करते हैं. नकारात्मक नियंत्रण (या पृष्ठभूमि शोर, नकली नियंत्रण) के बीच एक बड़ा अंतर है और नमूना वास्तविक स्क्रीनिंग शुरू करने से पहले स्थापित किया जाना है. सांख्यिकीय महत्व के लिए एक अच्छा उपाय Z कारक है. Z कारक समीकरण के बाद की गणना की जाती है:
Z = 1 - (3 एसडी नमूना [] + 3 एसडी [नकली]) * (| Av [नमूना] - Av [नकली] |) -1, एसडी के साथ: मानक विचलन, Av: औसत. एक 1 Z कारक> जेड> 0.5 नकारात्मक नियंत्रण के एक सांख्यिकीय महत्वपूर्ण सकारात्मक 7 नियंत्रण से जुदाई (और शोर) इंगित करता है.
4. प्राथमिक स्क्रीन
- ऊपर से अनुकूलित शर्तों के उपयोग esiRNAs के अभिकर्मक के लिए 384 अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेटें तैयार. यहाँ, हम 15ng प्रति 5μl ते बफर में अच्छी तरह से भंग esiRNA का उपयोग करें. प्लेट प्रति कम से कम आठ पदों के नियंत्रण जैविक अध्ययन प्रक्रिया के लिए उपयुक्त सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण (: Eg5 और यहाँ RLUC) के साथ लोड किया जाना चाहिए. से बचने की स्थिति प्रभाव बढ़त कुओं 5μl ते ही बफर के साथ लोड कर रहे हैं.
- मिश्रण जोड़ें 5μl (Invitrogen) OptiMEM प्रति 0.2μl Oligofectamine में अच्छी तरह से युक्त, और कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए सेते हैं.
- और 72 घंटे के लिए सेते हैं; अभिकर्मक (अच्छी तरह से प्रति 1000 कोशिकाओं के बराबर 25 कोशिकाओं / μl एकाग्रता पर एक HeLa सेल निलंबन के 40μl यहाँ) मिश्रण पर सेल निलंबन जोड़ें.
- एक स्वचालित माइक्रोस्कोप (ओलिंप ScanR, ऊपर देखें) पर डीएनए सामग्री उपाय. Z-स्कोर सभी नमूना esiRNAs संदर्भ के रूप में नकारात्मक नियंत्रण के लिए संकेत का उपयोग कर के लिए गणना कर रहे हैं: हिट चयन के लिए Z-स्कोर आँकड़ों का उपयोग कर का मूल्यांकन. ध्यान दें, Z-स्कोर Z कारक के रूप में ही नहीं है. Z-स्कोर एक नियंत्रण (नकली) की तुलना में एक नमूना मूल्यों के महत्व के लिए सांख्यिकीय उपाय प्रदान करते हैं. यह समीकरण निम्नलिखित गणना है:
Z = (मूल्य [नमूना] - औसतन [नकली]) * मानक विचलन [नकली] -1.
हिट चयन के लिए एक सीमा के लिए लागू किया जा गया है. आमतौर पर, एक महत्व मापदंड तरह: 2 <जेड -2 <प्रयोग किया जाता है, लेकिन डेटासेट के गुणवत्ता पर निर्भर करता है, जैविक प्रक्रिया या बस स्क्रीन के दायरे का अध्ययन किया, अलग थ्रेसहोल्ड लागू हो सकता है. काफी आसान Z-स्कोर आँकड़ों के अलावा भी अधिक विस्तृत गणितीय मूल्यांकन विधियों (स्क्रीनिंग डेटा का सांख्यिकीय मूल्यांकन के विस्तृत क्षेत्र में पहली बार एक अंदर मलो एट अल में पाया जा सकता है है 8.) इस्तेमाल किया जा सकता है.
5. माध्यमिक स्क्रीन और हिट सत्यापन
- एक माध्यमिक स्क्रीन प्राथमिक स्क्रीन करने के लिए प्रयोगात्मक त्रुटि या बंद लक्ष्य प्रभाव के कारण झूठी सकारात्मक को खत्म करने के बाद. चयनित हिट के लिए एक ही प्रक्रिया के रूप में प्राथमिक स्क्रीन में इस्तेमाल किया प्रतिकृति की एक बड़ी संख्या (3-5) के लिए दोहराया जाना चाहिए एक बेहतर सांख्यिकीय मूल्यांकन की अनुमति है.
- सत्यापित हिट के लिए प्रारंभिक स्क्रीन में लक्ष्यों की पहचान के खिलाफ एक माध्यमिक गैर अतिव्यापी esiRNA (या एक और मुंह बंद ट्रिगर गैर अतिव्यापी) किया जाना चाहिए. प्राथमिक स्क्रीन के लिए एक ही परख और पढ़ने के लिए बाहर के रूप में लागू किया जाना चाहिए.
- अंततः चयनित जीन पार प्रजातियों आरएनएआई 9 बचाव द्वारा मान्य किया जा सकता है . इस प्रकार एक जीवाणु जीन माउस ortholog उदाहरण कृत्रिम गुणसूत्र एन्कोडिंग (बीएसी) stably कोशिकाओं में ट्रांसफ़ेक्ट है. बीएसी - constructs अपनी जीनोमिक संदर्भ में एक जीन के संरक्षण और लगभग एक शारीरिक अभिव्यक्ति के लिए अनुमति देते हैं. अंतर्जात मानव जीन के खिलाफ आरएनएआई माउस transgene अभिव्यक्ति अनछुए जो आरएनएआई phenotype बचाता छोड़ देंगे. आरएनएआई बचाव आरएनएआई तिथि करने के लिए उपलब्ध phenotypes के सत्यापन के लिए सोने के मानक प्रदान करता है.
- अंत में, पुष्टि उम्मीदवारों और अधिक विस्तार में अध्ययन कर रहे हैं अंततः यंत्रवत समझ प्राप्त है. कई मामलों में आरएनएआई इन प्रयोगों में इस्तेमाल किया जा सकता है, जैसे माध्यमिक अधिक विस्तृत assays में.
Discussion
शाही सेना के हस्तक्षेप नुकसान के समारोह phenotypes का अध्ययन करने के लिए एक मानक तकनीक बन गया है. आरएनएआई मध्यस्थों के बड़े पैमाने पर संग्रह अलग आपूर्तिकर्ताओं से उपलब्ध हैं और जीन मुंह बंद करने के लिए एक आसान, लागत प्रभावी और तेजी से विधि प्रदान करते हैं. यह कई जैविक प्रक्रियाओं में प्रमुख खिलाड़ियों जीनोम पैमाने पर विभिन्न प्रजातियों और सेल प्रकार की एक विस्तृत श्रृंखला पर एक परिप्रेक्ष्य की अनुमति के लिए व्यवस्थित स्क्रीनिंग के लिए गेट खोला.
उच्च झूठी सकारात्मक और नकारात्मक झूठी दरों आरएनएआई स्क्रीन में एक आम चुनौती हैं. इस समस्या का समाधान करने के लिए, प्रभावकारिता में सुधार के लिए काफी प्रयास करने के लिए किया गया निवेश किया है और विशेष रूप में मुंह बंद करने की विशिष्टता से चलाता है. एक महत्वपूर्ण खोज थी कि अलग ही प्रतिलेख लक्ष्यीकरण siRNAs की एक पूल बहुत लक्ष्य विशिष्टता को बढ़ाता है. क्योंकि विभिन्न siRNAs की एक बहुत जटिल पूल endoribonuclease द्वारा निर्मित है, esiRNAs उच्च लक्ष्य विशिष्टता चलाता है, आरएनएआई स्क्रीन में झूठी सकारात्मक दर को कम करने. esiRNAs भी कुशल knockdowns प्राप्त करने के लिए, यह भी झूठी नकारात्मक दर को कम करने के लिए प्रदर्शन किया है.
क्योंकि आरएनएआई स्क्रीन तकनीकी की मांग कर रहे हैं, वे संभावना कुछ समय के लिए एक नियमित आधार पर प्रदर्शन करने के लिए चुनौतीपूर्ण रहेगा. हालांकि, अभिकर्मकों और उपकरणों के रूप में मिलता है बेहतर और अधिक प्रयोगशालाओं उनकी विशेषज्ञता का हिस्सा, आधुनिक जीव विज्ञान में आरएनएआई स्क्रीन का उपयोग करने के लिए भविष्य में वृद्धि माना जाता है.
Disclosures
लेखक वाणिज्यिक संस्थाओं है कि काम में प्रस्तुत एक रुचि हो सकता है के साथ वित्तीय संबंधों घोषणा.
Acknowledgments
हम चर्चा के लिए Buchholz प्रयोगशाला और सिग्मा Aldrich आरएनएआई टीम के सदस्यों को स्वीकार करना चाहते हैं. हम मैक्स प्लैंक सोसायटी और Bundesministerium फर Bildung und Forschung समर्थन के लिए [0315105] जाओ जैव Grands धन्यवाद देना चाहूंगा.
मिशन ® सिग्मा Aldrich जैव प्रौद्योगिकी एल.पी. के एक पंजीकृत ट्रेडमार्क है
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MISSION esiRNA | Sigma-Aldrich | For additional information contact: rnai@sial.com | |
| Wellmate | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| Breathable sealing tape | Corning | Breathable Sealing Tape, Sterile (Product #3345) | |
| OptiMEM | Invitrogen | ||
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | 200 proof (absolute), for molecular biology |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P5493 | BioReagent, 10x concentrate, suitable for cell culture, for molecular biology |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Sigma-Aldrich | D8417 | Poweder, BioReagent, suitable for cell culture, >98% (HPLC and TLC) |
| Ribonuclease A from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | R6513 | For molecular biology, ≥70 Kunitz units/mg protein, lyophilized powder |
| Tris-EDTA buffer solution | Sigma-Aldrich | T9285 | 100 x, for molecular biology |
References
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