Primaire neuronale culturen uit de hersenen van laat stadium Drosophila Poppen

Summary

Deze video toont de bereiding van primaire neuronale culturen uit de hersenen van laat stadium Drosophila poppen. Standpunten van levende culturen tonen neurietuitgroei en beeldvorming van calcium niveaus met behulp van Fura-2.

Abstract

In deze video, tonen we de voorbereiding van de primaire neuronale culturen uit de hersenen van laat stadium Drosophila poppen. De procedure begint met het verwijderen van hersenen van dieren op 70-78 uur na puparium vorming. De geïsoleerde hersenen worden weergegeven na een korte incubatie in papaïne gevolgd door verschillende wasbeurten in serum-vrij groeimedium. Het proces van mechanische dissociatie van elk brein in een 5 ul druppel van media op een dekglaasje wordt geïllustreerd. De axonen en dendrieten van de post-mitotische neuronen zijn sheered uit de buurt van de soma tijdens dissociatie, maar de neuronen beginnen te regenereren processen binnen een paar uur in de platen. Beelden tonen levende culturen op 2 dagen. Neuronen blijven om processen te werken tijdens de eerste week in de cultuur. Specifieke neuronale populaties kunnen worden geïdentificeerd met behulp van cultuur GAL4 lijnen om weefselspecifieke expressie van fluorescente merkers zoals GFP of RFP rijden. Hele cel opnames hebben aangetoond dat de gekweekte neuronen vorm functionele, spontaan actief cholinerge en GABA-erge synapsen. Een korte video-segment illustreert calcium dynamiek in de gekweekte neuronen met behulp van Fura-2 als een calcium indicator kleurstof tot spontane calcium transiënten en nicotine opgewekt calcium reacties in een schotel van gekweekte neuronen te controleren. Deze pop-hersenen culturen zijn een bruikbaar model systeem waarin genetische en farmacologische middelen kunnen worden gebruikt om intrinsieke en extrinsieke factoren die de vorming en de functie van centrale synapsen beïnvloeden te identificeren.

Protocol

Voorbereidingen voor de dag van het kweken:

1. Maak steriele ontleden oplossing.
2. Maak steriel DMEM en te houden in 10 ml bij 4 ° C gedurende 2 weken.
3. Maak steriel DDM2 supplementen en vries in 50 of 100 ul porties voor 1 maand.
4. Maak ConA / laminine.
5. Vacht dekglaasjes.
   Optioneel: Maak steriele CNBM en op te slaan ingevroren voor maximaal 4 maanden.

Op de dag van het kweken van

I. Bereid Enzyme Solution (ES) in laminaire flow hood

1. Doe 5 ml ontleden oplossing (DS) in een 15 ml centrifugebuis.
2. Weeg 0,8 mg van L-cysteïne in een 0,6 ml Eppendorf en voeg 150 ul van de DS. Pipet op en neer tot er kristallen zijn verdwenen.
3. Voeg 150 ml van de DS / Cysteïne om de 5 ml DS en meng goed.
4. Voeg 50 U (eenheden) van papaïne.
5. Voeg 7 ml 0,1 N Na OH en meng goed. Oplossing zal duidelijk binnen 30 minuten. wanneer geactiveerd.
6. Filter enzym oplossing met 0,2 mm spuit filter in een steriele 1,5 ml schroefdop microfugebuisje
   
   Papaïne: Wil je 50 E in 5 ml DS. Elke partij is iets anders, dus moeten berekenen hoeveel:
   37,3 mg / ml en 28,3 U / mg
   37,3 x 28,3 = 1055,59 U / ml (1000 ml)
   50 U = 47,4 ml
   

II. Maak DDM2 media

Op de dag van het kweken: voeg de volgende aanvullingen op DDM2 maken

Tot 10 ml van DMEM voeg de supplementen, net voor het kweken van:

1. 100μl Transferrine
2. 100μl putrescine
3. 100μl Selenium
4. 100μl Progesteron
5. 50μl Insuline
6. 10μl 20-hydroxyecdyson

Let op: Maak genoeg DDM2 voor de geplande alle culturen (elk brein uitgeplaat op een dekglaasje in een individueel 35 mm petrischaal, 1,5 ms van de media / cultuur)

Stap III-VI kan op een niet-steriele lab gedaan bank en moet worden voltooid in 45 minuten of minder.

III. Poppen Collection

1. Kies 10-15 poppen uit zijden van flacon onder een dissectie microscoop.
2. Plaats poppen in het deksel van een droge 35 mm petrischaal.

Opmerking: Wij over het algemeen hersenen gebruiken van poppen tussen 55-78 uur na puparium vorming (APF). Het is iets moeilijker te ontleden van de hersenen van de jongere poppen, omdat het hoofd capsules hebben de neiging in te storten, terwijl het algemene niveau van neurietuitgroei is iets lager uit de oudste poppen. In het kanton-S wildtype stam, worden deze stadia herkend door gepigmenteerde ogen die zijn licht bruin tot licht roodachtig, met weinig pigment elders.

IV. Onthoofding in dissectiemicroscoop

1. Plaats twee druppels steriele ontleden oplossing in het deksel van de petrischaal, naast de poppen.
2. Voorzichtig bezit zijn van een enkele pop met fijne tang in de linkerhand en gebruik een 27 gauge naald bevestigd aan een 1 cc spuit in de rechterhand om de cuticula te verwijderen aan het voorste einde van de pop.
3. Knijp een beetje pop met een pincet en het hoofd naar voren komt te gebruiken 27 gauge naald voor aan de hals verbreken.
4. Met de punt van de naald of de tang, transfer hoofd te laten vallen van het ontleden oplossing.
5. Herhaal dit tot je 10 tot 15 koppen in een enkele druppel.

V. Het verwijderen van de hersenen van hoofd onder dissectiemicroscoop

1. In elke hand bezit zijn van een 1 cc injectiespuit met een 27 gauge naald.
2. Gebruik deze om de vliegen kop positie in de daling van ontleden oplossing, zodat de snuit is naar u toe en het dorsale oppervlak van de kop is het noorden.
3. Steek de linkernaald in de proboscis aan het hoofd vast te pinnen en het recht naald te gebruiken om een ​​spleet te maken in het rechter oog, dat gaat van de ventrale naar het dorsale oppervlak.
4. Steek de rechternaald de buurt van de links in de regio van de proboscis en gebruik vervolgens de linker naald om de cuticula zachtjes drukken over het linker oog, waardoor de hersenen in de richting van de gleuf in het rechter oog. De hersenen moeten komen uit de gleuf aan de rechterkant, relatief intact, vaak met zowel optische lobes nog steeds vast en soms ook de gepigmenteerde oogweefsel ook.
5. Duw de hersenen op de achterkant van de naald en transfer naar een daling van de steriele zoutoplossing in het ontleden van een nieuwe steriele, 35 mm petrischaaltje.
6. Verzamel 10-15 hersenen voor elk genotype.
   

VI. Verwijdering van optische lobben en enzym behandeling

1. In elke hand bezit zijn van een 1 cc injectiespuit met een 27 gauge naald en deze gebruiken om alle breinen te verzamelen in een klein gebied van de druppel ontleden oplossing
2. Gebruik spuiten bijvoorbeeld snijgereedschap aan de optische kwabben te verwijderen uit elke hersenen, zodat het weefsel nog voor cultuur is het centrale hersengebied.
3. Gebruik een 20 ul Pipetman, vastgesteld op 5 pi, om alle de hersenen van een enkel genotype transfer naar een Eppendorf buisje met 1 ml van de steriele papaïne oplossing.
4. Hersenen geïncubeerd in papaïne voor 10-15 minuten op een rotator ingesteld op 60 rpm.
5. Centrifugeer bij 3000 rpm gedurende 3 minuten.
   

Binnen steriele laminaire stroming capuchon - alle stappen waar weefsel wordt blootgesteld aan lucht moet worden gedaan in laminaire stroming kap voor de resterende stappen.

VII. Het wassen

1. Verwijder de enzym oplossing en te vervangen door steriele ontleden oplossing.
2. Centrifugeer bij 3000 rpm gedurende 3 minuten.
3. Wassen met steriele ontleden oplossing een totaal 3 keer.
4. Verwijder ontleden zout en te vervangen door DDM2.
5. Centrifuge en was een totaal van 2 keer met DDM2.
6. Overdracht hersenen en media om een ​​steriele 35 mm petrischaal.
   

VIII. Aanwrijving en Plating onder dissectiemicroscoop

1. Plaats 5 ul van DDM2 in het centrum van een dekglaasje aan.
2. Overdracht een hersenen om deze daling van DDM2 met een gele punt.
3. Onder de microscoop, gebruik van 27 gauge naalden te puntentotaal hersenen in kleine stukjes (moet <1 minuut duren).
4. Onder visuele begeleiding, breek het uiteinde van een glazen pipet die is getrokken op een fijne punt, zodat de grotere stukken kan voorzichtig worden gezogen in de punt van de pipet en verdreven terug in het medium. We maken gebruik van mond zuig-buizen die worden standaard geleverd met 100 ul hematocriet capillaire glas.
   
   Let op: Zorg ervoor dat u bubbels te krijgen in de media en je moet empirisch bepalen wat de beste grootte pipet te gebruiken. Goeden kunt u naar de hersenen scheiden met een aantal individuele cellen en nog steeds enkele grote klompen, in ongeveer 30 seconden / hersenen. Wanneer je kijkt naar deze bij een hogere macht, moet ongeveer 10-20% van de neuronen hebben nog een aantal processen nog, en er zal nog een paar grote klonten. Als u te veel losmaken, vervolgens alle cellen zullen worden rond en zij zullen hebben geleden zoveel schade zullen ze niet overleven. Deze stap vraagt ​​oefening en moet snel worden gedaan, omdat er een grote oppervlakte-volume verhouding en de osmolaliteit en de pH van de daling van DDM2 kan snel veranderen. Weefsel moet worden geplaatst in CO ₂ incubator zo snel mogelijk.
   
   
5. Schrijven op het petrischaaltje deksel: "Genotype, datum en tijd".
6. Zet de 35 mm petrischaal in een 100 mm petrischaal (met natte kimwipe) en laat zich in de CO ₂ incubator gedurende 30 minuten.
7. Overstroming van de 35 mm gerecht met 1,5 ml DDM2.
8. Houd culturen in de incubator bij 5% CO ₂ incubator (23 ° C).
   
   Opmerking: Als u geen toegang hebt tot een afkoeling van CO ₂ incubator, gebruik dan een standaard weefsel van zoogdieren cultuur incubator en of het in een koele ruimte en warmte tot 23 ° C, of zet in het lab, uit te schakelen temp en gebruik ijs in een lade aan de onderkant van de incubator op temp regelen rond ambient.
   

IX. Feeding Cellen

1. Op dag een (volgende dag), voeg 0,5 ml van CNBM/B27 (geconditioneerde media) om 03:01 DDM2 maken: CNBM/B27.
2. Op dag 5 vervangen door 1 ml van de media voor 03:01 DDM2: CNBM/B27.
3. Blijven voeden cellen met 3:01 DDM2: CNBM/B27 om de 4-5 dagen.
   
   Opmerking: Culturen kan worden geteeld zonder de niet-neuronale geconditioneerde media, maar de neuronen lijken een beetje meer kwetsbaar en zijn moeilijker voor gebruik in de elektrofysiologie experimenten.

Discussion

Neuronen geoogst uit de hersenen van het embryo / de postnatale knaagdieren kunnen worden gekweekt in de primaire cel cultuur waar ze uit te breiden neurieten en vormen functionele synaptische verbindingen. Methoden voor de voorbereiding van deze culturen zijn goed ingeburgerd en studies in knaagdieren neuronale culturen hebben een cruciale rol gespeeld bij het identificeren van genen en omgevingsfactoren betrokken zijn bij de regulering van synapsvorming en functie (Banker en Goslin, 1991). Terwijl insect neuronen uit een verscheidenheid van soorten kunnen ook worden gekweekt in cultuur, het enige insect neuronen aangetoond dat functionele synaptische verbindingen in de cultuur vorm zijn van Drosophila (Rohrbough et al., 2003). Neuroblasts geoogst mid-gastrulastadium Drosophila embryo's gekweekt in bepaalde media aanleiding geven tot neuronen die elektrisch prikkelbaar en vormen functionele, interneuronal synaptische verbindingen (O'Dowd, 1995; Lee en O'Dowd, 1999). Factoren te identificeren die synaptische vorm en functie in neuronen bekend is dat ze betrokken bij de bemiddeling volwassen gedrag ontwikkelden we de techniek geïllustreerd in deze video voor het oogsten en het kweken neuronen van de hersenen van de laat stadium Drosophila (Su en O'Dowd, 2003) te reguleren. Een van de belangrijkste kenmerken van deze procedure was het papaïne, in plaats van collagenase of andere agressieve enzymen die traditioneel gebruikt in de bereiding van insecten neuronale culturen gebruiken. Papaïne resulteert in gedissocieerde neuronen te behouden korte axonale processen die overleven, regenereren neuritische processen en vormen functionele interneuronal synaptische verbindingen. Hele opnamen in geïdentificeerd celpopulaties, waaronder paddestoel lichaam Kenyon cellen, laten zien dat snelle excitatoire synaptische transmissie in de culturen wordt gemedieerd door nAChRs terwijl remming wordt gemedieerd GABA-receptoren (Su en O'Dowd, 2003). Onze recente elektronenmicroscopische analyse toont aan dat de neuronen in cultuur vorm synapsen met structurele kenmerken die vergelijkbaar zijn met zowel de chemische en elektrische synapsen in de volwassen hersenen (Oh et al., 2007).. Zoals geïllustreerd in de video, de culturen zijn ook vatbaar zijn voor Fura-2 calcium imaging studies en we hebben deze naar de cellulaire mechanismen die ten grondslag liggen spontaan en opgewekt veranderingen in de intracellulaire calcium niveaus in geïdentificeerd celpopulaties waaronder Kenyon cellen en cholinerge neuronen (Jiang et onderzoeken al., 2005;. Campusano et al., 2007).. Met de uitgebreide genetische tool kit beschikbaar in Drosophila deze cultuur-systeem biedt een zeer nuttig hulpmiddel voor het identificeren van intrinsieke en extrinsieke toezichthouders van de centrale synaps structuur, functie, en plasticiteit.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Concanavalin A		Sigma-Aldrich	C-2010	To 2.5 mL DS, add 25 mg Concanavalin A bottle. This is 10 mg/ml concentration.Make aliquots of 90 ul and store at -20 °C, no longer than 3 months.
Laminin		Sigma-Aldrich	L-2020	Add 1 mL DS to 1mg Laminin bottle. This is 0.5 mg/mL concentration.Make aliquots of 10 μL and store at -20 °C, no longer than 3 months.
Coverslips		Bellco Glass	1943-00012	12 mm glass coverslips
ConA + Laminin solution				Stock solution, from Con A stock and laminin stock, for coverslip coating: Add in 5 mL DS, 83.5 μL of ConA (167 μg/mL) and 8.35 μuL of Laminin (0.835 μg/mL). Mix. Make aliquots of 100 μL and store at -20 °C, not longer than a month.
Dissecting Solution	Buffer			For 500 ml: 400 ml Ultra filtered water + 25 ml Stock Solution A + 14 ml Stock Solution B + 3.0 g (33.3 mM) D (+)-Glucose (Sigma G-8270) + 7.5 g (43.8 mM) Sucrose (Sigma S-0389). Adjust pH to 7.4 with 1N NaOH (around 2 ml). Bring final volume to 500 ml with ultra filtered water. Decant into a clean glass bottle and autoclave. Label "Dissecting Solution" and store at 4?C.
Dissecting Solution	Buffer			For 500 ml: 400 ml Ultra filtered water + 25 ml Stock Solution A + 14 ml Stock Solution B + 3.0 g (33.3 mM) D (+)-Glucose (Sigma G-8270) + 7.5 g (43.8 mM) Sucrose (Sigma S-0389). Adjust pH to 7.4 with 1N NaOH (around 2 ml). Bring final volume to 500 ml with ultra filtered water. Decant into a clean glass bottle and autoclave. Label "Dissecting Solution" and store at 4?C.
Solution B: HEPES	Buffer	Sigma-Aldrich	H-3375	20.97g (9.9mM). Add ultra filtered water up to 200 ml. Mix until dissolve and bring final volume to 250 ml. Place in a clean bottle and autoclave. Label "Solution B" and store at 4 C.
Solution A	Buffer			For 500 ml: 80.0g (137 mM) NaCl (Sigma S-9625) + 4.0g (5.4mM) KCl (Sigma P-4504) + 0.24g (0.17mM) Na2HPO4 (Sigma S-0876) + 0.3g (0.22 mM) KH2PO4 (Sigma P-5379).Weigh out all ingredients and mix until dissolved with 400 ml ultra filtered water. Bring final volume to 500 ml. Place in a clean bottle and autoclave. Label "Solution A" and store at 4°C.
Coating Coverslips:Put autoclaved coverslips in a 60 mm petri dish.Pipet 5 ul of Con A/Laminin mix onto center of each coverslip.Place in 37 C incubator for 2 hours.Rinse 3x coverslips with 100 ul of autoclaved water each. Use vacuum attached to a sterile Pasteur pipet.During the last rinse, pick up the coverslip with forceps and dry both sides.Transfer the coverslip to a 35mm Petri dish.Store at room temperature for up to a month.