Primäre neuronale Kulturen aus den Gehirnen von Late Stage Drosophila Puppen

Summary

Dieses Video zeigt die Herstellung von primären neuronalen Kulturen aus den Gehirnen von Spätstadium Drosophila Puppen. Ansichten von lebenden Kulturen zeigen Neuritenwachstum und Bildgebung von Calcium-Spiegel mit Fura-2.

Abstract

In diesem Video zeigen wir die Herstellung von primären neuronalen Kulturen aus den Gehirnen von Spätstadium Drosophila Puppen. Das Verfahren beginnt mit der Entfernung der Gehirne von Tieren, bei 70-78 Std. nach Puparium Bildung. Die isolierte Gehirne sind nach kurzer Inkubationszeit in Papain von mehreren Wäschen in serumfreien Wachstumsmedium gefolgt gezeigt. Der Prozess der mechanischen Dissoziation jedes Gehirn in einem 5-ul Tropfen Medien auf einem Deckglas dargestellt. Die Axone und Dendriten der post-mitotischen Neuronen off in der Nähe des Soma während Dissoziation sheered aber die Neuronen beginnen, um Prozesse innerhalb von wenigen Stunden plating regenerieren. Bilder zeigen, lebende Kulturen in 2 Tagen. Neuronen weiterhin Prozesse während der ersten Woche in Kultur zu erarbeiten. Speziellen neuronalen Populationen können in Kultur identifiziert werden mit GAL4 Linien gewebespezifische Expression von fluoreszierenden Markern wie GFP oder RFP-Laufwerk. Ganzzell-Aufnahmen haben gezeigt, den kultivierten Neuronen bilden funktionelle, spontan aktive cholinergen und GABAergen Synapsen. Ein kurzes Video Segment zeigt Calcium-Dynamik in der kultivierten Neuronen mit Fura-2 als Kalzium-Indikator-Farbstoff zu spontanen Kalzium Transienten und Nikotin hervorgerufenen Calcium-Reaktionen in eine Schüssel mit kultivierten Neuronen zu überwachen. Diese Puppen Gehirn Kulturen sind ein nützliches Modell, bei dem genetische und pharmakologische Werkzeuge zur inneren und äußeren Faktoren, die Bildung und Funktion von zentralen Synapsen beeinflussen identifiziert werden können.

Protocol

Vorbereitungen vor dem Tag der Kultivierung:

1. Machen Sie sterile Sezieren Lösung.
2. Machen Sie sterile DMEM und behalten in 10 ml Aliquots bei 4 ° C für 2 Wochen.
3. Machen Sie sterile DDM2 Ergänzungen und frieren in 50 oder 100 ul Aliquots für 1 Monat.
4. Machen ConA / Laminin.
5. Coat Deckgläser.
   Optional: Stellen sterile CNBM und Speicher für bis zu 4 Monate eingefroren.

Am Tag der Kultivierung

I. Vorbereitung Enzymlösung (ES) in Laminarströmungshaube

1. Setzen Sie 5 ml zu sezieren Lösung (DS) in einer 15 ml-Zentrifugenröhrchen.
2. Wiegen 0,8 mg L-Cystein in einem 0,6 ml Eppendorf und fügen 150 ul DS. Pipette auf und ab, bis sich Kristalle verschwunden sind.
3. Add 150 ml DS / Cysteine ​​an die 5 ml DS und gut mischen.
4. Add 50 U (Einheiten) von Papain.
5. Add 7 ml 0,1 N Na OH und gut mischen. Lösung wird innerhalb von 30 min klar. wenn aktiviert.
6. Filter Enzymlösung mit 0,2 mm Spritzenfilter in ein steriles 1,5 ml Schraubverschluss Mikrozentrifugenröhrchen
   
   Papain: Want 50 U in 5 ml DS. Jede Charge ist etwas anders, so muss berechnen, wie viel:
   37,3 mg / ml und 28,3 U / mg
   37,3 x 28,3 = 1055,59 U / ml (1000 ml)
   50 U = 47,4 ml
   

II. Machen DDM2 Medien

Am Tag der Kultivierung: fügen Sie die folgenden Ergänzungen zu machen DDM2

Zu 10 ml DMEM fügen Sie die Ergänzungen, kurz vor Kultivierung:

1. 100 &mgr; l Transferrin
2. 100 &mgr; Putrescin
3. 100 &mgr; l Selen
4. 100 &mgr; l Progesteron
5. 50 ul Insulin
6. 10 &mgr; l 20-Hydroxyecdysone

Hinweis: Achten Sie genug DDM2 für alle Kulturen geplant (jedes Gehirn auf einem einzigen Deckglas in eine individuelle 35 mm Petrischale, 1,5 ms der Medien / Kultur verchromt)

Step III-VI kann mit einer nicht sterilen getan Labortisch und sollte in 45 Minuten oder weniger abgeschlossen sein.

III. Puppen-Sammlung

1. Wählen Sie 10-15 Puppen von Seiten der Flasche unter einem Binokular.
2. Legen Sie Puppen in den Deckel einer trockenen 35 mm Petrischale.

Hinweis: Wir verwenden in der Regel Gehirn aus Puppen zwischen 55-78 Stunden nach Puparium Bildung (APF). Es ist etwas schwieriger zu sezieren das Hirn aus der jüngeren Puppen da der Kopf Kapseln zum Einsturz neigen, während das gesamte Niveau der Neuritenwachstum ist etwas geringer aus dem ältesten Puppen. In der Canton-S Wildtypstamm, werden diese Phasen durch pigmentierte Augen, hellbraune bis leicht rötlich anerkannt sind, mit wenig Pigment anderswo.

IV. Enthauptung unter Präpariermikroskop

1. Legen Sie zwei Tropfen sterile Sezieren Lösung im Deckel der Petrischale, neben Puppen.
2. Vorsichtig halten eine einzige Puppe mit feinen Pinzetten in der linken Hand und mit einem 27-Gauge-Kanüle an einer 1 ml-Spritze in die rechte Hand auf die Nagelhaut am vorderen Ende der Puppe zu entfernen.
3. Squeeze Puppe leicht mit einer Pinzette und als Leiter entsteht verwenden 27-Gauge-Nadel, um den Hals zu durchtrennen.
4. Mit der Nadelspitze oder der Zange, Transfer Kopf bis zu sezieren Lösung fallen zu lassen.
5. Wiederholen, bis vor einem 10-15 Köpfe in einem einzigen Tropfen haben.

V. Entfernung des Gehirns von Kopf unter Präpariermikroskop

1. In jeder Hand halten eine 1 ml-Spritze mit einer 27-Gauge-Nadel.
2. Verwenden Sie diese, um die Fliege den Kopf in den Tropfen zu sezieren Lösung so den Rüssel steht vor Ihnen und der dorsalen Oberfläche des Kopfes liegt nördlich Position.
3. Setzen Sie die linke Nadel in den Rüssel auf den Kopf festnageln und mit der rechten Nadel, um einen Schlitz in das rechte Auge, die von der ventralen zur dorsalen Fläche hinausgeht.
4. Legen Sie die rechte Nadel in der Nähe der linken in die Region des Rüssels und dann mit der linken Nadel vorsichtig drücken Sie die Nagelhaut über dem linken Auge, schob das Gehirn auf den Schlitz in das rechte Auge. Das Gehirn soll aus dem Schlitz auf der rechten Seite auftauchen, relativ intakt, oft mit beiden optischen lobes noch angebracht und manchmal auch die pigmentierte Augengewebes auch.
5. Schieben Sie das Gehirn auf die Rückseite der Nadel und den Transfer zu einem Rückgang der sterile Kochsalzlösung zerlegt in eine neue sterile, 35 mm Petrischale.
6. Sammeln 10-15 Gehirn für jeden Genotyp.
   

VI. Entfernung von Sehlappen und Enzymbehandlung

1. In jeder Hand halten eine 1 ml-Spritze mit einer 27-Gauge-Nadel und nutzen diese, um alle Gehirne in einem kleinen Bereich des Tropfens zu sezieren Lösung sammeln
2. Verwenden Sie Spritzen als Schneidwerkzeuge der optischen Loben von jedem Gehirn zu entfernen, damit das Gewebe bleibt für Kultur ist die zentrale Region des Gehirns.
3. Verwenden Sie eine 20 ul Pipetman, bei 5 ul gesetzt, für alle die Gehirne von einem einzigen Genotyp in ein Eppendorf-Röhrchen mit 1 ml sterilem Papain-Lösung übertragen.
4. Brains in Papain für 10-15 Minuten auf einem Rotator bei 60 rpm inkubiert.
5. Zentrifugation bei 3000 rpm für 3 Minuten.
   

Innerhalb sterile Laminarströmungshaube - alle Schritte, bei denen Gewebe der Luft ausgesetzt ist, sollte in Laminarströmungshaube für die verbleibenden Schritte getan werden.

VII. Waschen

1. Entfernen Enzymlösung und ersetzen mit steriler Sezieren Lösung.
2. Zentrifugation bei 3000 rpm für 3 Minuten.
3. Waschen mit sterilem Sezieren Lösung insgesamt 3-mal.
4. Entfernen Sie sezieren Kochsalzlösung und ersetzen mit DDM2.
5. Zentrifuge und waschen insgesamt 2-mal mit DDM2.
6. Transfer-Köpfe und Medien, um eine sterile 35 mm Petrischalen.
   

VIII. Trituration und Plating unter Präpariermikroskop

1. Platz 5 ul DDM2 in der Mitte des Deckglases.
2. Transfer 1 Gehirn, diese Tropfen DDM2 mit einer gelben Spitze.
3. Unter dem Mikroskop, verwenden 27-Gauge-Nadel, um Würfel Gehirn in kleine Stücke (sollte <1 Minute dauern).
4. Unter visuelle Führung, brechen die Spitze einer Glaspipette, die zu einer feinen Spitze gezogen worden ist, so dass die größeren Teile können leicht in die Spitze der Pipette angesaugt und wieder in das Medium vertrieben. Wir verwenden Mund Saugrohre, die standardmäßig mit 100 ul Hämatokrit Kapillare Glas kommen.
   
   Hinweis: Achten Sie darauf, Blasen in den Medien zu bekommen und Sie müssen empirisch zu bestimmen, die beste Größe Pipette zu verwenden. Guten ermöglichen es Ihnen, das Gehirn mit einzelnen Zellen und noch einige große Klumpen distanzieren, in ca. 30 Sekunden / Gehirn. Wenn Sie an diesen Blick auf höhere Gewalt, sollte ca. 10-20% der Neuronen noch einige Prozesse noch und es wird noch einige große Klumpen werden. Wenn Sie distanzieren zu viel, dann alle Zellen werden rund und sie wird so viel Schaden, den sie nicht überleben wird erlitten haben. Dieser Schritt erfordert Übung und muss schnell erfolgen, da gibt es ein großes Oberflächen-zu-Volumen-Verhältnis und die Osmolalität und pH-Wert der Tropfen DDM2 kann sich schnell ändern. Tissue muss in CO _2-Inkubator gelegt werden so schnell wie möglich.
   
   
5. Schreiben Petrischale Deckel: "Genotype, Datum und Uhrzeit".
6. Setzen Sie die 35 mm Petrischale in einem 100 mm Petrischale (mit nassen Kimwipe) und lassen Sie siedeln sich in der CO _2-Inkubator für 30 min.
7. Flood die 35 mm-Schale mit 1,5 ml DDM2.
8. Keep Kulturen in den Brutschrank bei 5% CO _2-Inkubator (23 ° C).
   
   Hinweis: Wenn Sie keinen Zugang zu einer Abkühlung CO _2-Inkubator, verwenden Sie ein Standard-Säugetier-Zellkultur-Inkubator und entweder steckte es in einen kühlen Raum und Wärme bis 23 ° C, oder im Labor setzen, schalten Sie temp, und verwenden Sie Eis in einem Fach an der Unterseite des Inkubators zu temp um Umgebungslicht zu regeln.
   

IX. Feeding Cells

1. Am Tag 1 (nächster Tag), 0,5 ml CNBM/B27 (konditionierte Medien) zum 3:1 DDM2 machen: CNBM/B27.
2. Am Tag 5 ersetzen 1 ml der Medien für 03.01 DDM2: CNBM/B27.
3. Keep Fütterung Zellen mit 3:1 DDM2: CNBM/B27 alle 4-5 Tage.
   
   Hinweis: Kulturen können ohne die nicht-neuronalen konditionierten Medien angebaut werden, aber die Neuronen scheint ein wenig zerbrechlich und sind schwieriger für die Verwendung in der Elektrophysiologie Experimente.

Discussion

Neuronen aus dem Gehirn von embryonalen / postnatale Nagetiere geerntet werden in primären Zellkulturen gezüchtet werden, wo sie Neuriten und erweitern Form funktioneller synaptischer Verbindungen. Methoden zur Herstellung dieser Kulturen sind gut etabliert und Studien in Nagetieren neuronalen Kulturen haben eine entscheidende Rolle bei der Identifizierung von Genen und Umweltfaktoren bei der Regulierung der Synapsenbildung und Funktion (Banker und Goslin, 1991) beteiligt gespielt. Während Insekten Neuronen aus einer Vielzahl von Arten können auch in Kultur gezüchtet werden, sind die einzigen Insekten Neuronen gezeigt, dass funktionelle synaptische Verbindungen in Kultur bilden aus Drosophila (Rohrbough et al, 2003). Neuroblasten geerntet Mitte Gastrulastadium Drosophila Embryonen in definierten Medien gewachsen Anlass zu Neuronen, die elektrisch erregbaren und bilden funktionelle, interneuronalen synaptischen Verbindungen (O'Dowd, 1995; Lee und O'Dowd, 1999). So identifizieren Sie Faktoren, die synaptische Form und Funktion in Neuronen bekannt, bei der Vermittlung von Erwachsenen Verhaltensweisen, die wir entwickelt die Technik in diesem Video für die Ernte und die Kultivierung Neuronen aus Gehirnen von Spätstadium Drosophila (Su und O'Dowd, 2003) dargestellt beteiligt sein zu regulieren. Eines der wichtigsten Merkmale dieses Verfahrens war es, Papain, anstelle von Kollagenase oder andere aggressive Enzyme traditionell in Vorbereitung der Insekten neuronalen Kulturen verwendet wird. Papain Ergebnisse in dissoziierten Neuronen Beibehaltung kurzer axonalen Prozessen, die überleben, regenerieren neuritischen Prozesse und bilden funktionelle interneuronalen synaptischen Verbindungen. Whole-Aufnahmen in identifizierten Zellpopulationen, einschließlich Pilzkörper Kenyon-Zellen, zeigen, dass schnelle exzitatorische synaptische Transmission in den Kulturen von nAChRs vermittelt wird, während die Hemmung GABA-Rezeptoren (Su und O'Dowd, 2003) vermittelt wird. Unsere jüngsten elektronenmikroskopische Analyse zeigt, dass die Neuronen in Kultur bilden Synapsen mit strukturellen Eigenschaften, die ähnlich wie die chemischen und elektrischen Synapsen im erwachsenen Gehirn (Oh et al., 2007). Wie im Video dargestellt, sind die Kulturen auch zugänglich für Fura-2 Calcium-Imaging-Studien, und wir haben diese verwendet werden, um die zellulären Mechanismen, die spontane und evozierte Veränderungen der intrazellulären Calcium-Spiegel in identifizierten Zellpopulationen einschließlich Kenyon Zellen und cholinergen Neuronen (Jiang et untersuchen al, 2005;. Campusano et al, 2007).. Mit dem umfangreichen genetischen Tool-Kit verfügbar in Drosophila dieser Kultur-System bietet ein sehr nützliches Werkzeug zur Identifizierung von innerer und äußerer Regulatoren der zentralen Synapse Struktur, Funktion und Plastizität.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Concanavalin A		Sigma-Aldrich	C-2010	To 2.5 mL DS, add 25 mg Concanavalin A bottle. This is 10 mg/ml concentration.Make aliquots of 90 ul and store at -20 °C, no longer than 3 months.
Laminin		Sigma-Aldrich	L-2020	Add 1 mL DS to 1mg Laminin bottle. This is 0.5 mg/mL concentration.Make aliquots of 10 μL and store at -20 °C, no longer than 3 months.
Coverslips		Bellco Glass	1943-00012	12 mm glass coverslips
ConA + Laminin solution				Stock solution, from Con A stock and laminin stock, for coverslip coating: Add in 5 mL DS, 83.5 μL of ConA (167 μg/mL) and 8.35 μuL of Laminin (0.835 μg/mL). Mix. Make aliquots of 100 μL and store at -20 °C, not longer than a month.
Dissecting Solution	Buffer			For 500 ml: 400 ml Ultra filtered water + 25 ml Stock Solution A + 14 ml Stock Solution B + 3.0 g (33.3 mM) D (+)-Glucose (Sigma G-8270) + 7.5 g (43.8 mM) Sucrose (Sigma S-0389). Adjust pH to 7.4 with 1N NaOH (around 2 ml). Bring final volume to 500 ml with ultra filtered water. Decant into a clean glass bottle and autoclave. Label "Dissecting Solution" and store at 4?C.
Dissecting Solution	Buffer			For 500 ml: 400 ml Ultra filtered water + 25 ml Stock Solution A + 14 ml Stock Solution B + 3.0 g (33.3 mM) D (+)-Glucose (Sigma G-8270) + 7.5 g (43.8 mM) Sucrose (Sigma S-0389). Adjust pH to 7.4 with 1N NaOH (around 2 ml). Bring final volume to 500 ml with ultra filtered water. Decant into a clean glass bottle and autoclave. Label "Dissecting Solution" and store at 4?C.
Solution B: HEPES	Buffer	Sigma-Aldrich	H-3375	20.97g (9.9mM). Add ultra filtered water up to 200 ml. Mix until dissolve and bring final volume to 250 ml. Place in a clean bottle and autoclave. Label "Solution B" and store at 4 C.
Solution A	Buffer			For 500 ml: 80.0g (137 mM) NaCl (Sigma S-9625) + 4.0g (5.4mM) KCl (Sigma P-4504) + 0.24g (0.17mM) Na2HPO4 (Sigma S-0876) + 0.3g (0.22 mM) KH2PO4 (Sigma P-5379).Weigh out all ingredients and mix until dissolved with 400 ml ultra filtered water. Bring final volume to 500 ml. Place in a clean bottle and autoclave. Label "Solution A" and store at 4°C.
Coating Coverslips:Put autoclaved coverslips in a 60 mm petri dish.Pipet 5 ul of Con A/Laminin mix onto center of each coverslip.Place in 37 C incubator for 2 hours.Rinse 3x coverslips with 100 ul of autoclaved water each. Use vacuum attached to a sterile Pasteur pipet.During the last rinse, pick up the coverslip with forceps and dry both sides.Transfer the coverslip to a 35mm Petri dish.Store at room temperature for up to a month.