תרבויות עצבית ראשונית של המוח של Late Stage תסיסנית גלמים

Summary

וידאו זה מדגים את הכנת תרביות נוירונים העיקרי של המוח של המנוח בשלב תסיסנית גלמים. צפיות של תרבויות לחיות להראות תוצאה neurite הדמיה של רמות הסידן באמצעות Fura-2.

Abstract

בסרטון הזה אנחנו מדגימים הכנת תרבויות העצבית העיקרי של המוח של המנוח בשלב תסיסנית גלמים. ההליך מתחיל עם סילוקו של מוחות מחיות ב 70-78 שעות לאחר היווצרות puparium. המוח מבודד מוצגים לאחר דגירה קצרה papain ואחריו שוטף מספר בינוני סרום ללא צמיחה. תהליך ניתוק מכני של המוח כל טיפה 5 ul של התקשורת על coverslip מודגם. האקסונים והדנדריטים של הפוסט mitotic הנוירונים התרחק ליד סומה במהלך דיסוציאציה אבל הנוירונים מתחילים מחדש תהליכים בתוך כמה שעות של ציפוי. תמונות להראות תרבויות לחיות 2 ימים. נוירונים להמשיך לפרט תהליכים במהלך השבוע הראשון בתרבות. אוכלוסיות נוירונים מסוימים ניתן לזהות בתרבות באמצעות GAL4 קווי לנהוג ביטוי רקמות ספציפיות של סמנים ניאון כגון GFP או RFP. הקלטות שלמות התא הדגימו את נוירונים בתרבית טופס פונקציונלי, סינפסות cholinergic ו GABAergic פעיל באופן ספונטני. קטע וידאו קצר ממחיש הדינמיקה סידן נוירונים בתרבית באמצעות Fura-2 כמו צבע אינדיקטור סידן לפקח הארעיים סידן ספונטנית ניקוטין התגובות סידן עורר בצלחת של נוירונים בתרבית. אלו תרבויות המוח גלמי הם מערכת מודל שימושי אילו כלים גנטיים תרופתי יכול לשמש כדי לזהות גורמים פנימיים וחיצוניים המשפיעים על היווצרות ותפקוד של סינפסות המרכזית.

Protocol

הכנות לפני יום culturing:

1. בצע פתרון מנתחים סטרילית.
2. הפוך את DMEM סטרילית ושומרים aliquots 10 מ"ל ב 4 מעלות צלזיוס למשך 2 שבועות.
3. בצע סטרילי DDM2 תוספי הקפאת 50 או 100 aliquots μl במשך חודש 1.
4. הפוך את ConA / laminin.
5. מעיל coverslips.
   אופציונלי: בצע CNBM חנות סטרילית להקפיא עד 4 חודשים.

ביום של culturing

I. הכן פתרון אנזימים (ES) במנדף תזרים למינרית

1. שים 5 מ"ל של ביתור פתרון (DS) בצינור צנטריפוגה 15 מ"ל.
2. לשקול 0.8 מ"ג ציסטאין-L ב 0.6 מ"ל Eppendorf ולהוסיף 150 μl של DS. פיפטה למעלה ולמטה עד הקריסטלים נעלמו.
3. מוסיפים 150 מ"ל של DS / ציסטאין על DS 5 מ"ל ומערבבים היטב.
4. הוסף 50 U (יחידות) של Papain.
5. הוסף 7 מ"ל של 0.1 N Na OH ומערבבים היטב. הפתרון יהיה ברור בתוך 30 דקות. כאשר מופעל.
6. אנזים פתרון סינון עם מסנן 0.2 מ"מ מזרק לתוך צינור סטרילי 1.5 מ"ל כובע בורג microfuge
   
   Papain: רוצה 50 U DS ב 5 מ"ל. כל אצווה שונה במקצת, אז צריך לחשב כמה:
   37.3 מ"ג / מ"ל ​​ו - 28.3 U / מ"ג
   37.3 x 28.3 = 1055.59 U / ml (1000 מ"ל)
   50 U = 47.4 מ"ל
   

השנייה. הפוך את DDM2 התקשורת

ביום של culturing: להוסיף את התוספים הבאים כדי DDM2

עד 10 מ"ל של DMEM להוסיף את התוספים, ממש לפני culturing:

1. 100μl transferrin
2. 100μl Putrescine
3. 100μl סלניום
4. 100μl הפרוגסטרון
5. 50μl אינסולין
6. 10μl 20-Hydroxyecdysone

הערה: בצע מספיק DDM2 לכל התרבויות המתוכנן (כל המוח מצופה על coverslip יחיד צלחת פטרי 35 מ"מ בודדים, 1.5 ms התקשורת / תרבות)

שלב III-VI יכול להיות על הספסל נעשה במעבדה nonsterile ואמור להסתיים תוך 45 דקות או פחות.

ג. אוסף גלמים

1. בחר 10-15 גלמים משני של הבקבוקון תחת מיקרוסקופ לנתח.
2. המקום גלמים במכסה של צלחת פטרי 35 מ"מ יבש.

הערה: אנו משתמשים בדרך כלל במוחם של גלמים בין 55-78 שעות לאחר היווצרות puparium (APF). זה מעט קשה יותר לנתח את המוח של גלמים הצעיר מאז כמוסות ראש נוטים לקרוס, בעוד הרמה הכללית של תולדה neurite נמוכה מעט מ גלמים הבכור. בשנת המתח wildtype קנטון-S, בשלבים אלה מוכרים על ידי פיגמנט בעיניים כי הם חום בהיר עד מעט אדמדם, עם פיגמנט מעט במקום אחר.

IV. עריפת ראש תחת מיקרוסקופ לנתח

1. מניחים שתי טיפות של תמיסת לנתח סטרילי בתוך מכסה של צלחת פטרי, ליד גלמים.
2. בעדינות להחזיק גולם אחד עם מלקחיים קנס ביד שמאל ולהשתמש 27 מזרק מחט מד מצורף מזרק 1 סמ"ק ביד ימין כדי להסיר את העור המת בקצה הקדמי של גולם.
3. לסחוט מעט גולם עם מלקחיים כראש עולה 27 להשתמש מחט מד לנתק את הצוואר.
4. עם קצה של מחט או מלקחיים, העברת ראש טיפת לנתח פתרון.
5. חזור על הפעולה עד שיש לך 10-15 ראשי בטיפה אחת.

V. הסרת המוח מהראש תחת מיקרוסקופ לנתח

1. ביד כל אחד להחזיק מזרק 1 סמ"ק עם מחט מד 27.
2. השתמש אלה לתפקיד ראש לטוס ירידה של ביתור פתרון כל כך חוטם פונה אליך את פני השטח הגבי של הראש הוא בצפון.
3. הכנס את המחט שמאלה אל חוטם כדי להצמיד את הראש למטה ולהשתמש מחט הזכות לבצע חתך בעין ימין העובר מן הגחון אל פני השטח הגבי.
4. הכנס את המחט ממש ליד שמאל באזור חוטם ולאחר מכן להשתמש במחט משמאל בעדינות לדכא את הקוטיקולה מעל העין השמאלית, דוחפים את המוח לכיוון החריץ בעין ימין. המוח צריך לצאת מן חריץ בצד ימין, ללא פגע יחסית, לעתים קרובות עם שני lo אופטייםBES עדיין מחוברת ולפעמים רקמת העין פיגמנט גם כן.
5. דחוף את המוח על גבו של המחט ולהעביר לירידה של תמיסת מלח סטרילית לנתח בצלחת חדש סטרילי, 35 מ"מ פטרי.
6. איסוף 10-15 מוחות עבור כל גנוטיפ.
   

VI. הסרת אונות אופטיים וטיפול אנזים

1. ביד כל אחד להחזיק מזרק 1 סמ"ק עם מחט 27 מד ולהשתמש אלה כדי לאסוף את כל המוחות בתחום אחד קטן של ירידה של פתרון לנתח
2. שימוש במזרקים כמו כלי חיתוך כדי להסיר את האונות אופטיים מהמוח כל כך את הרקמה הנותרת לתרבות הוא האזור במוח המרכזי.
3. השתמש pipetman 20 μl, נקבע μl 5, להעביר את כל במוחם של גנוטיפ יחיד צינור Eppendorf המכילה 1 מ"ל של תמיסת papain סטרילית.
4. המוח מודגרות ב papain במשך 10-15 דקות על קבוצה מסובב ב 60 סל"ד.
5. צנטריפוגה בסל"ד 3000 למשך 3 דקות.
   

בתוך מכסה המנוע זרימה למינרית סטרילי - כל השלבים שבו רקמה חשוף לאוויר צריך להיעשות ברדס זרימה למינרית עבור השלבים הנותרים.

VII. כביסה

1. הסר פתרון אנזים ולהחליף פתרון מנתחים סטרילית.
2. צנטריפוגה בסל"ד 3000 למשך 3 דקות.
3. לשטוף עם פתרון לנתח סטרילי בסך הכל 3 פעמים.
4. הסר מלוחים לנתח ולהחליף DDM2.
5. צנטריפוגה ולשטוף בסך הכל 2 פעמים עם DDM2.
6. העברת מוח התקשורת מ"מ צלחת פטרי סטרילית 35.
   

VIII. טחינה דקה ו ציפוי תחת מיקרוסקופ לנתח

1. מקום 5 ul של DDM2 במרכז coverslip.
2. העברת 1 המוח ירידה זו של DDM2 עם קצה צהוב.
3. מתחת למיקרוסקופ, להשתמש במחטים 27 מד אל הקוביות את המוח לחתיכות קטנות (צריך לקחת <1 דקה).
4. תחת הדרכתו חזותיים, לשבור את קצה pipet כוס כי כבר משך לנקודה קנס כך חלקים גדולים יותר יכולים להישאב לתוך בעדינות קצה pipet וגורשו בחזרה לתוך המדיום. אנו משתמשים צינורות יניקה בפה כי מגיעות כסטנדרט עם זכוכית 100 המטוקריט μl נימי.
   
   הערה: הקפד לא לקבל בועות בתקשורת תצטרך אמפירי לקבוע את גודל pipet הטובה ביותר לשימוש. אלה טובים מאפשרים לך לנתק את המוח עם כמה תאים בודדים ועדיין כמה גושים גדולים, כ -30 שניות / המוח. כשאתה מסתכל על אלה בהספק גבוה יותר, כ 10-20% של נוירונים צריך עדיין יש כמה תהליכים שנותרו עדיין יהיו כמה גושים גדולים. אם לנתק יותר מדי, אז כל התאים יהיו עגולים יהיה להם נזק נגרם כל כך הרבה הם לא ישרדו. צעד זה דורש תרגול חייב להיעשות במהירות מאז יש יחס גדול משטח ל-נפח osmolality ו-pH של ירידה של DDM2 יכול להשתנות במהירות. רקמות צריך להיות ממוקם בתוך חממה CO ₂ במהירות האפשרית.
   
   
5. כתוב על מכסה צלחת פטרי ", גנוטיפ התאריך והשעה".
6. שים את 35 מ"מ צלחת פטרי בתוך צלחת פטרי 100 מ"מ (עם kimwipe רטוב) ולתת להתיישב CO ₂ באינקובטור למשך 30 דקות.
7. המבול צלחת 35 מ"מ עם 1.5 מ"ל של DDM2.
8. שמור תרבויות בחממה של 5% CO ₂ באינקובטור (23 ° C).
   
   הערה: אם אין לך גישה ל-CO ₂ באינקובטור קירור, השתמש תקן יונקים בתרבית רקמה החממה או לשים אותו בחדר חום קריר עד 23 ° C, או לשים במעבדה, לכבות זמני, ולהשתמש מגש קרח בחלק התחתון של החממה להסדיר זמני סביב הסביבה.
   

IX. האכלה תאים

1. ביום 1 (למחרת), להוסיף 0.5 מ"ל של CNBM/B27 (Media אילף) כדי להפוך 03:01 DDM2: CNBM/B27.
2. ביום 5 להחליף 1 מ"ל של התקשורת 03:01 DDM2: CNBM/B27.
3. שמור תאים האכלה עם 03:01 DDM2: CNBM/B27 כל 4-5 ימים.
   
   הערה: תרבויות ניתן לגדל בלי הלא ממוזג אבל התקשורת העצבית הנוירונים נראים קצת שבירים יותר וקשה יותר לשימוש בניסויים electrophysiology.

Discussion

נוירונים שנקטפו מן המוח של מכרסמים עובריים / לאחר הלידה ניתן לגדל בתרבית תאים העיקרי שבו הם להאריך neurites וליצור קשרים סינפטיים תפקודית. שיטות הכנה של תרבויות אלה מבוססים היטב מחקרים בתרבויות מכרסם העצבית יש תפקיד קריטי בזיהוי גנים וגורמים סביבתיים מעורבים ויסות היווצרות פונקציה סינפסה ו (הבנקאי Goslin, 1991). בעוד הנוירונים חרקים ממגוון רחב של מינים יכול להיות גם גדל בתרבות, הנוירונים חרקים רק הראו ליצור קשרים סינפטיים פונקציונלי בתרבות הם מן תסיסנית (Rohrbough et al, 2003). Neuroblasts שנקטפו אמצע gastrula שלב עוברים תסיסנית גדל מדיה מוגדר להצמיח נוירונים הם להתרגש חשמלית בצורה פונקציונלית, קשרים סינפטיים איטרניורונאליים (או 'דאוד, 1995; לי אודוד, 1999). כדי לזהות את הגורמים המווסתים צורה ותפקוד הסינפטי בנוירונים ידוע להיות מעורב בתיווך ההתנהגות הבוגרת פיתחנו את הטכניקה מאויר בסרטון הזה נוירונים קציר culturing מתוך מוחם של המנוח בשלב תסיסנית (סו ו אודוד, 2003). אחת התכונות המרכזיות של הליך זה היה להשתמש papain, במקום collagenase או אנזימים קשים אחרים המשמשים באופן מסורתי כהכנה תרבויות העצבית חרקים. תוצאות Papain בנוירונים ניתק שמירה על תהליכי axonal קצר לשרוד, להתחדש תהליכים מדלקת עצבים, וליצור קשרים סינפטיים איטרניורונאליים פונקציונלי. הקלטות שלמים אוכלוסיות תאים שזוהו, לרבות תאים בגוף פטריות קניון, מראים כי מהירות העברת סינפטיים מעוררים בתרבויות היא בתיווך nAChRs תוך עיכוב מתווכת קולטני GABA (סו ו אודוד, 2003). ניתוח מיקרוסקופי אלקטרונים האחרונות שלנו מוכיח כי נוירונים וסינפסות טופס תרבות עם תכונות מבניות הדומות הכימי והן סינפסות חשמליות במוח הבוגר (הו et al. 2007). כפי שמודגם בסרטון, תרבויות הם גם מקובל Fura-2 בדיקות הדמיה סידן השתמשנו אלה כדי לחקור את המנגנונים הבסיסיים הסלולר שינויים ספונטנית ועוררה רמות הסידן תאיים בתוך אוכלוסיות תאים המזוהים כולל תאים קניון ונוירונים cholinergic (ג'יאנג et al, 2005;. Campusano et al, 2007).. עם ערכת כלי מקיף הגנטי זמין תסיסנית מערכת זו תרבות מספק כלי מאוד שימושי עבור זיהוי הרגולטורים פנימי חיצוני של מבנה הסינפסה תפקיד מרכזי, ו הפלסטיות.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Concanavalin A		Sigma-Aldrich	C-2010	To 2.5 mL DS, add 25 mg Concanavalin A bottle. This is 10 mg/ml concentration.Make aliquots of 90 ul and store at -20 °C, no longer than 3 months.
Laminin		Sigma-Aldrich	L-2020	Add 1 mL DS to 1mg Laminin bottle. This is 0.5 mg/mL concentration.Make aliquots of 10 μL and store at -20 °C, no longer than 3 months.
Coverslips		Bellco Glass	1943-00012	12 mm glass coverslips
ConA + Laminin solution				Stock solution, from Con A stock and laminin stock, for coverslip coating: Add in 5 mL DS, 83.5 μL of ConA (167 μg/mL) and 8.35 μuL of Laminin (0.835 μg/mL). Mix. Make aliquots of 100 μL and store at -20 °C, not longer than a month.
Dissecting Solution	Buffer			For 500 ml: 400 ml Ultra filtered water + 25 ml Stock Solution A + 14 ml Stock Solution B + 3.0 g (33.3 mM) D (+)-Glucose (Sigma G-8270) + 7.5 g (43.8 mM) Sucrose (Sigma S-0389). Adjust pH to 7.4 with 1N NaOH (around 2 ml). Bring final volume to 500 ml with ultra filtered water. Decant into a clean glass bottle and autoclave. Label "Dissecting Solution" and store at 4?C.
Dissecting Solution	Buffer			For 500 ml: 400 ml Ultra filtered water + 25 ml Stock Solution A + 14 ml Stock Solution B + 3.0 g (33.3 mM) D (+)-Glucose (Sigma G-8270) + 7.5 g (43.8 mM) Sucrose (Sigma S-0389). Adjust pH to 7.4 with 1N NaOH (around 2 ml). Bring final volume to 500 ml with ultra filtered water. Decant into a clean glass bottle and autoclave. Label "Dissecting Solution" and store at 4?C.
Solution B: HEPES	Buffer	Sigma-Aldrich	H-3375	20.97g (9.9mM). Add ultra filtered water up to 200 ml. Mix until dissolve and bring final volume to 250 ml. Place in a clean bottle and autoclave. Label "Solution B" and store at 4 C.
Solution A	Buffer			For 500 ml: 80.0g (137 mM) NaCl (Sigma S-9625) + 4.0g (5.4mM) KCl (Sigma P-4504) + 0.24g (0.17mM) Na2HPO4 (Sigma S-0876) + 0.3g (0.22 mM) KH2PO4 (Sigma P-5379).Weigh out all ingredients and mix until dissolved with 400 ml ultra filtered water. Bring final volume to 500 ml. Place in a clean bottle and autoclave. Label "Solution A" and store at 4°C.
Coating Coverslips:Put autoclaved coverslips in a 60 mm petri dish.Pipet 5 ul of Con A/Laminin mix onto center of each coverslip.Place in 37 C incubator for 2 hours.Rinse 3x coverslips with 100 ul of autoclaved water each. Use vacuum attached to a sterile Pasteur pipet.During the last rinse, pick up the coverslip with forceps and dry both sides.Transfer the coverslip to a 35mm Petri dish.Store at room temperature for up to a month.