Summary
इस वीडियो देर चरण ड्रोसोफिला pupae के दिमाग से प्राथमिक neuronal संस्कृतियों की तैयारी को दर्शाता है. जीना संस्कृतियों के दृश्य neurite और कैल्शियम Fura - 2 का उपयोग स्तर के परिणाम इमेजिंग दिखा.
Abstract
इस वीडियो में, हम देर चरण ड्रोसोफिला pupae के दिमाग से प्राथमिक neuronal संस्कृतियों की तैयारी को प्रदर्शित करता है. प्रक्रिया जानवरों से दिमाग के puparium गठन के बाद 70-78 बजे हटाने के साथ शुरू होता है. पृथक दिमाग papain में संक्षिप्त ऊष्मायन कई washes के द्वारा सीरम मुक्त मध्यम विकास में बाद के बाद दिखाया जाता है. coverslip पर मीडिया के एक 5 उल ड्रॉप में प्रत्येक मस्तिष्क के यांत्रिक पृथक्करण की प्रक्रिया सचित्र है. बाद mitotic न्यूरॉन्स के axons और dendrites से सोम निकट sheered हैं हदबंदी के दौरान, लेकिन न्यूरॉन्स चढ़ाना के कुछ ही घंटों के भीतर प्रक्रियाओं को पुनर्जीवित शुरू. छवियाँ 2 दिन पर रहते संस्कृतियों दिखा. न्यूरॉन्स संस्कृति में पहले सप्ताह के दौरान प्रक्रियाओं विस्तृत जारी है. विशिष्ट neuronal आबादी संस्कृति में पहचाना जा सकता है है GAL4 लाइनों का उपयोग करने के लिए ऊतक GFP या आरएफपी जैसे फ्लोरोसेंट मार्करों के विशिष्ट अभिव्यक्ति ड्राइव. पूरे सेल रिकॉर्डिंग प्रदर्शन किया है सभ्य न्यूरॉन्स कार्यात्मक, अनायास सक्रिय cholinergic और GABAergic synapses के रूप में. एक लघु वीडियो खंड सभ्य न्यूरॉन्स एक कैल्शियम सूचक डाई के रूप में Fura-2 का उपयोग करने के लिए सहज कैल्शियम और सभ्य न्यूरॉन्स के एक डिश में यात्रियों निकोटीन पैदा कैल्शियम प्रतिक्रियाओं की निगरानी में कैल्शियम की गतिशीलता दिखाता है. ये pupal मस्तिष्क संस्कृतियों में जो आनुवांशिक और औषधीय उपकरण आंतरिक और बाह्य कारकों है कि गठन और केंद्रीय synapses के समारोह प्रभाव की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है एक उपयोगी मॉडल प्रणाली रहे हैं.
Protocol
संवर्धन के दिन से पहले तैयारी:
- बाँझ विदारक समाधान करें.
- बाँझ DMEM और 4 में 10 मिलीलीटर aliquots में रखने ° C 2 सप्ताह के लिए.
- 1 महीने के लिए 50 या 100 μl aliquots में बाँझ DDM2 खुराक और स्थिर करें.
- ConA / laminin बनाओ.
- कोट coverslips.
वैकल्पिक: बाँझ CNBM और स्टोर करने के लिए 4 महीने के लिए जमे हुए.
संवर्धन के दिन
मैं लामिना का प्रवाह हुड में एनजाइम समाधान (ते) तैयार
- एक 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में समाधान (डी एस) विदारक के 5 मिलीलीटर रखो.
- वजन एक 0.6 मिलीलीटर Eppendorf में एल Cysteine के 0.8 मिलीग्राम और 150 डी एस के μl जोड़ें. पिपेट और नीचे जब तक क्रिस्टल गए हैं.
- डी एस / 5 मिलीलीटर डी एस Cysteine की 150 मिलीलीटर जोड़ें और मिश्रण अच्छी तरह से.
- Papain के 50 U (यूनिट) जोड़ें.
- 0.1 एन ना ओह 7 मिलीलीटर जोड़ें और मिश्रण अच्छी तरह से. समाधान 30 मिनट के भीतर साफ हो जाएगा. जब सक्रिय है.
- एक बाँझ 1.5 मिलीलीटर पेंच टोपी microfuge ट्यूब में 0.2 मिमी सिरिंज फिल्टर के साथ फ़िल्टर एंजाइम समाधान
Papain: 5 मिलीलीटर डी एस में 50 यू चाहते हैं. प्रत्येक बैच थोड़ा अलग है, तो कितना गणना करना चाहिए:
37.3 मिलीग्राम / एमएल और 28.3 यू मिलीग्राम /
37.3 28.3 x = 1055.59 यू / एमएल (1000 मिलीलीटर)
50 यू = 47.4 मिलीलीटर
द्वितीय. DDM2 मीडिया
संवर्धन के दिन में: निम्नलिखित की खुराक को जोड़ने के लिए बनाने के DDM2
DMEM के 10 के लिए मिलीलीटर की खुराक संवर्धन, बस से पहले जोड़:
- 100μl transferrin
- 100μl Putrescine
- 100μl सेलेनियम
- 100μl प्रोजेस्टेरोन
- 50μl इंसुलिन
- 10μl 20-Hydroxyecdysone
नोट: सभी संस्कृतियों की योजना बनाई (प्रत्येक मस्तिष्क में एक व्यक्ति 35 मिमी पेट्री डिश में एक एकल coverslip, मीडिया के 1.5 एमएस / संस्कृति पर चढ़ाया) के लिए पर्याप्त DDM2 बनाओ
चरण III छठी किया nonsterile प्रयोगशाला बेंच पर और 45 मिनट या उससे कम समय में पूरा किया जाना चाहिए कर सकते हैं.
III. Pupae संग्रह
- एक विदारक माइक्रोस्कोप के अंतर्गत शीशी की तरफ से 10-15 pupae का चयन करें.
- एक सूखी 35 मिमी पेट्री डिश के ढक्कन प्लेस में pupae.
नोट: हम आम तौर पर pupae से puparium गठन (APF) के बाद 55-78 घंटे के बीच दिमाग का उपयोग करें. यह थोड़ा करने के लिए बाहर छोटी pupae से मस्तिष्क काटना मुश्किल है के बाद से सिर कैप्सूल पतन करते हैं, जबकि neurite परिणाम के समग्र स्तर सबसे पुराना pupae से थोड़ा कम है. गुआंगज़ौ-एस wildtype तनाव में, इन चरणों pigmented आँखें है कि हल्के भूरे रंग थोड़ा लाल द्वारा मान्यता प्राप्त कर रहे हैं, कहीं थोड़ा वर्णक के साथ.
चतुर्थ. विदारक माइक्रोस्कोप के तहत कत्ल
- प्लेस बाँझ समाधान के विदारक पेट्री डिश के ढक्कन में दो बूँदें, अगले pupae.
- धीरे बाएं हाथ में ठीक संदंश के साथ एक एकल कोषस्थ कीट और पकड़ एक 27 गेज सिरिंज दाहिने हाथ में एक सीसी सिरिंज से जुड़ी कोषस्थ कीट के पूर्वकाल अंत में छल्ली हटायें सुई का उपयोग करें.
- कोषस्थ कीट संदंश के साथ थोड़ा और निचोड़ के रूप में सिर उभर 27 गेज सुई का उपयोग करने के लिए गर्दन तोड़.
- सुई या संदंश के टिप के साथ, सिर समाधान विदारक के ड्रॉप हस्तांतरण.
- दोहराएँ जब तक आप एक बूंद में 10-15 सिर है.
मस्तिष्क के सिर से विदारक माइक्रोस्कोप के अंतर्गत वी. हटाना
- प्रत्येक हाथ में एक 27 गेज सुई के साथ एक 1 सीसी सिरिंज पकड़.
- विदारक समाधान ताकि आप सूंड और सिर के पृष्ठीय सतह उत्तर है का सामना करना पड़ रहा है की बूंद में मक्खी के सिर की स्थिति के लिए इन का उपयोग करें.
- सिर पिन नीचे और सही सुई का उपयोग करने के लिए सही आँख है कि उदर से पृष्ठीय सतह को चला जाता है में एक भट्ठा बनाने सूंड में बाएँ सुई डालें.
- सूंड के क्षेत्र में छोड़ के पास सही सुई डालें और फिर बाईं सुई का उपयोग करने के लिए धीरे बाईं आंख पर छल्ली दबाना, भट्ठा की ओर सही नज़र में मस्तिष्क धक्का. मस्तिष्क के लिए दाईं तरफ भट्ठा से उभरने, अपेक्षाकृत बरकरार चाहिए दोनों ऑप्टिक लो के साथ अक्सर,bes अभी भी जुड़ी है और कभी कभी pigmented आँख के ऊतकों के रूप में अच्छी तरह से.
- सुई और एक नया बाँझ, 35 मिमी पेट्री डिश में बाँझ विदारक खारा की एक बूंद के लिए स्थानांतरण की पीठ पर मस्तिष्क पुश.
- प्रत्येक जीनोटाइप के लिए 10-15 दिमाग लीजिए.
छठी. ऑप्टिक lobes के हटाना और एंजाइम उपचार
- प्रत्येक हाथ में एक 27 गेज सुई के साथ एक 1 सीसी सिरिंज पकड़ और इन का उपयोग करने के लिए विदारक समाधान की बूंद के एक छोटे से क्षेत्र में सभी के दिमाग इकट्ठा
- उपकरण काटने प्रत्येक मस्तिष्क से ऑप्टिक lobes हटाने ताकि संस्कृति के लिए शेष ऊतक केंद्रीय मस्तिष्क क्षेत्र है के रूप में सीरिंज का उपयोग करें.
- एक 20 μl pipetman, 5 μl पर सेट है, का प्रयोग एक Eppendorf बाँझ papain समाधान के 1 मिलीलीटर युक्त ट्यूब के लिए एक एकल जीनोटाइप के दिमाग को हस्तांतरण.
- 60 rpm पर एक अंग को घुमानेवाली पेशी सेट पर 10-15 मिनट के लिए papain में incubated दिमाग.
- 3 मिनट के लिए 3000 rpm पर अपकेंद्रित्र.
लामिना का प्रवाह हुड में बाँझ लामिना का प्रवाह हुड के अंदर सभी कदम है जहां ऊतक हवा के संपर्क में है शेष चरणों के लिए किया जाना चाहिए.
सातवीं. वॉशिंग
- एंजाइम समाधान निकालें और बाँझ विदारक समाधान के साथ बदलें.
- 3 मिनट के लिए 3000 rpm पर अपकेंद्रित्र.
- बाँझ विदारक समाधान के साथ 3 बार के एक कुल धो लें.
- विदारक खारा निकालें और DDM2 के साथ की जगह.
- अपकेंद्रित्र और DDM2 के साथ 2 बार के एक कुल धोने.
- एक बाँझ 35 मिमी पेट्री डिश के लिए दिमाग और मीडिया स्थानांतरण.
आठवीं. Trituration और विदारक माइक्रोस्कोप के अंतर्गत चढ़ाना
- Coverslip के केंद्र में 5 DDM2 की उल रखें.
- एक पीले रंग की टिप के साथ DDM2 के इस बूंद के लिए मस्तिष्क 1 स्थानांतरण.
- माइक्रोस्कोप के तहत, 27 गेज सुई का उपयोग करने के लिए छोटे टुकड़े (<1 मिनट लेना चाहिए) में मस्तिष्क पासा.
- दृश्य मार्गदर्शन के अंतर्गत, एक गिलास pipet है कि ठीक एक बिंदु के लिए खींच लिया है इतना है कि बड़े टुकड़े धीरे pipet की टिप में चूसा जा सकता है और मध्यम में वापस निष्कासित कर दिया की नोक को तोड़ने. हम मुंह चूषण ट्यूब है कि 100 μl हेमाटोक्रिट केशिका गिलास के साथ मानक आओ उपयोग करें.
नोट: ध्यान रखना मीडिया में बुलबुले नहीं मिलता और आप empirically सबसे अच्छा आकार का उपयोग करने के लिए pipet निर्धारित करने की आवश्यकता होगी. अच्छे लोगों को आप कुछ व्यक्तिगत कोशिकाओं और अभी भी कुछ बड़े clumps के साथ मस्तिष्क अलग कर देना करने के लिए के बारे में 30 सेकंड / मस्तिष्क में, अनुमति देते हैं. जब आप उच्च शक्ति पर इन पर देखो, न्यूरॉन्स की लगभग 10-20% अभी भी कुछ शेष प्रक्रियाओं चाहिए और वहाँ अभी भी कुछ बड़े clumps किया जाएगा. यदि आप बहुत ज्यादा अलग कर देना, तो सभी कक्षों दौर हो सकता है और वे इतना नुकसान वे नहीं बच जाएगा निरंतर होगा. यह कदम अभ्यास लेता है और जल्दी से किया जाना चाहिए क्योंकि वहाँ एक बड़े सतह करने वाली मात्रा अनुपात और osmolality और DDM2 की बूंद के पीएच जल्दी से बदल सकते हैं है. ऊतक सीओ 2 इनक्यूबेटर में रखा जा जितनी जल्दी संभव की जरूरत है. - पेट्री डिश ढक्कन "जीनोटाइप, दिनांक, और समय" पर लिखें.
- एक 100 मिमी पेट्री डिश में 35 मिमी पेट्री डिश (गीला kimwipe के साथ) रखो और 30 मिनट के लिए सीओ 2 इनक्यूबेटर में बसा है.
- बाढ़ DDM2 की 1.5 मिलीलीटर के साथ 35 मिमी पकवान.
- इनक्यूबेटर में 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर (23 डिग्री सेल्सियस) पर संस्कृतियों का रखें .
नोट: यदि आप एक ठंडा सीओ 2 इनक्यूबेटर करने के लिए उपयोग नहीं है, एक मानक स्तनधारी टिशू कल्चर इनक्यूबेटर का उपयोग करें और या तो एक शांत कमरे और गर्मी में यह 23 के लिए डाल ° सी, या प्रयोगशाला में डाल दिया, बंद अस्थायी बारी, और उपयोग परिवेश के आसपास अस्थायी विनियमित इनक्यूबेटर के नीचे पर एक ट्रे में बर्फ.
ग्यारहवीं. दूध पिलाने कक्ष
- दिवस 1 (अगले दिन) में, CNBM/B27 की 0.5 मिलीलीटर (वातानुकूलित मीडिया) को जोड़ने के लिए 03:01 DDM2: CNBM/B27.
- CNBM/B27: 5 दिवस पर 03:01 DDM2 के लिए मीडिया के 1 मिलीग्राम की जगह.
- CNBM/B27 हर 4-5 दिन: 03:01 DDM2 खिला कोशिकाओं के साथ रखें.
नोट: संस्कृति गैर neuronal वातानुकूलित मीडिया के बिना विकसित किया जा सकता है है, लेकिन न्यूरॉन्स एक थोड़ा और अधिक नाजुक दिखाई देते हैं और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी प्रयोगों में उपयोग के लिए और अधिक कठिन है.
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Discussion
भ्रूण / प्रसवोत्तर कृन्तकों के दिमाग से काटा न्यूरॉन्स प्राथमिक सेल संस्कृति में उगाया जा सकता है, जहां वे neurites विस्तार और कार्यात्मक synaptic कनेक्शन फार्म है. इन संस्कृतियों की तैयारी के लिए तरीके और अच्छी तरह से स्थापित कर रहे हैं कृंतक neuronal संस्कृतियों में अध्ययन synapse गठन और समारोह के विनियमन (बैंकर और Goslin, 1991) में शामिल जीन और पर्यावरणीय कारकों की पहचान करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है. जबकि प्रजाति की एक किस्म से कीट न्यूरॉन्स भी संस्कृति में विकसित किया जा सकता है, केवल कीट संस्कृति में कार्यात्मक synaptic कनेक्शन के रूप में दिखाया न्यूरॉन्स ड्रोसोफिला (Rohrbough एट अल, 2003) से कर रहे हैं. Neuroblasts काटा मध्य गेसट्रुला चरण ड्रोसोफिला परिभाषित मीडिया में हो भ्रूण न्यूरॉन्स कि विद्युत उत्तेजनीय और कार्यात्मक, interneuronal synaptic कनेक्शन फार्म (O'Dowd, 1995; ली और O'Dowd, 1999) को जन्म दे. कारक है कि वयस्क व्यवहार हम तकनीक विकसित की देर चरण में ड्रोसोफिला (र और O'Dowd, 2003) दिमाग से कटाई और संवर्धन न्यूरॉन्स के लिए इस वीडियो में सचित्र mediating में शामिल हो जाना जाता न्यूरॉन्स में synaptic फार्म और समारोह को विनियमित करने की पहचान करने के लिए. इस प्रक्रिया के एक प्रमुख विशेषताओं के papain, collagenase या अन्य कठोर पारंपरिक रूप से कीट neuronal संस्कृतियों की तैयारी में इस्तेमाल किया एंजाइमों के बजाय का उपयोग किया गया था. Dissociated न्यूरॉन्स में कम axonal प्रक्रियाओं है कि जीवित बनाए रखने papain परिणाम, neuritic प्रक्रियाओं, पुनर्जन्म और कार्यात्मक interneuronal synaptic कनेक्शन फार्म. पहचान मशरूम शरीर Kenyon कोशिकाओं सहित सेल आबादी में पूरा रिकॉर्डिंग दिखाने के लिए, कि तेजी से संस्कृतियों में उत्तेजक synaptic प्रसारण nAChRs द्वारा मध्यस्थता है जबकि निषेध GABA रिसेप्टर्स (र और O'Dowd, 2003) मध्यस्थता है. हमारे हाल के इलेक्ट्रॉन सूक्ष्म विश्लेषण दर्शाता है कि संरचनात्मक सुविधाओं की है कि दोनों वयस्क दिमाग में रासायनिक और बिजली synapses (ओह एट अल., 2007) के लिए समान हैं के साथ संस्कृति प्रपत्र synapses में न्यूरॉन्स. के रूप में वीडियो में सचित्र, संस्कृतियों को भी Fura दो कैल्शियम इमेजिंग अध्ययन करने के लिए उत्तरदायी हैं और हम इन का इस्तेमाल किया है करने के लिए सेलुलर पहचान Kenyon कोशिकाओं और cholinergic न्यूरॉन्स (जियांग एट सहित सेल आबादी में intracellular कैल्शियम का स्तर में सहज और पैदा परिवर्तन अंतर्निहित तंत्र की जांच अल, 2005; Campusano एट अल, 2007).. व्यापक आनुवंशिक उपकरण ड्रोसोफिला में उपलब्ध किट के साथ इस संस्कृति प्रणाली केंद्रीय synapse संरचना, समारोह, और plasticity की आंतरिक और बाह्य नियामकों की पहचान के लिए एक बहुत ही उपयोगी उपकरण प्रदान करता है.
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Acknowledgments
यह काम NIH अनुदान NS27501 के द्वारा DKOD समर्थित किया गया. इस काम के लिए अतिरिक्त समर्थन DKOD HHMI प्रोफेसर कार्यक्रम के माध्यम से समर्थन में UC Irvine के लिए एक अनुदान द्वारा प्रदान की गई थी.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Concanavalin A | Sigma-Aldrich | C-2010 | To 2.5 mL DS, add 25 mg Concanavalin A bottle. This is 10 mg/ml concentration.Make aliquots of 90 ul and store at -20 °C, no longer than 3 months. | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L-2020 | Add 1 mL DS to 1mg Laminin bottle. This is 0.5 mg/mL concentration.Make aliquots of 10 μL and store at -20 °C, no longer than 3 months. | |
| Coverslips | Bellco Glass | 1943-00012 | 12 mm glass coverslips | |
| ConA + Laminin solution | Stock solution, from Con A stock and laminin stock, for coverslip coating: Add in 5 mL DS, 83.5 μL of ConA (167 μg/mL) and 8.35 μuL of Laminin (0.835 μg/mL). Mix. Make aliquots of 100 μL and store at -20 °C, not longer than a month. | |||
| Dissecting Solution | Buffer | For 500 ml: 400 ml Ultra filtered water + 25 ml Stock Solution A + 14 ml Stock Solution B + 3.0 g (33.3 mM) D (+)-Glucose (Sigma G-8270) + 7.5 g (43.8 mM) Sucrose (Sigma S-0389). Adjust pH to 7.4 with 1N NaOH (around 2 ml). Bring final volume to 500 ml with ultra filtered water. Decant into a clean glass bottle and autoclave. Label "Dissecting Solution" and store at 4?C. | ||
| Dissecting Solution | Buffer | For 500 ml: 400 ml Ultra filtered water + 25 ml Stock Solution A + 14 ml Stock Solution B + 3.0 g (33.3 mM) D (+)-Glucose (Sigma G-8270) + 7.5 g (43.8 mM) Sucrose (Sigma S-0389). Adjust pH to 7.4 with 1N NaOH (around 2 ml). Bring final volume to 500 ml with ultra filtered water. Decant into a clean glass bottle and autoclave. Label "Dissecting Solution" and store at 4?C. | ||
| Solution B: HEPES | Buffer | Sigma-Aldrich | H-3375 | 20.97g (9.9mM). Add ultra filtered water up to 200 ml. Mix until dissolve and bring final volume to 250 ml. Place in a clean bottle and autoclave. Label "Solution B" and store at 4 C. |
| Solution A | Buffer | For 500 ml: 80.0g (137 mM) NaCl (Sigma S-9625) + 4.0g (5.4mM) KCl (Sigma P-4504) + 0.24g (0.17mM) Na2HPO4 (Sigma S-0876) + 0.3g (0.22 mM) KH2PO4 (Sigma P-5379).Weigh out all ingredients and mix until dissolved with 400 ml ultra filtered water. Bring final volume to 500 ml. Place in a clean bottle and autoclave. Label "Solution A" and store at 4°C. | ||
| Coating Coverslips:Put autoclaved coverslips in a 60 mm petri dish.Pipet 5 ul of Con A/Laminin mix onto center of each coverslip.Place in 37 C incubator for 2 hours.Rinse 3x coverslips with 100 ul of autoclaved water each. Use vacuum attached to a sterile Pasteur pipet.During the last rinse, pick up the coverslip with forceps and dry both sides.Transfer the coverslip to a 35mm Petri dish.Store at room temperature for up to a month. | ||||
References
- Culturing Nerve Cells. Banker, G., Goslin, K. , MIT Press. Cambridge. (1991).
- Rohrbough, J., O'Dowd, D. K., Baines, R. A., Broadie, K. Cellular bases of behavioral plasticity: Establishing and Modifying synaptic circuits in the Drosophila Genetic System. J. Neurobiol. 54, 254-271 (2003).
- O'Dowd, D. K. Voltage-gated currents and firing properties of embryonic Drosophila neurons grown in a chemically defined medium. J. Neurobiol. 27, 113-126 (1995).
- Lee, D., O'Dowd, D. K. Fast excitatory synaptic transmission mediated by nAChR in cultured Drosophila neurons. J. Neurosci. 19, 5311-5321 (1999).
- Su, H., O'Dowd, D. K. Fast synaptic currents in Drosophila mushroom body Kenyon cells are mediated by alpha-bungarotoxin-sensitive nAChRs and picrotoxin-sensitive GABA receptors. J. Neurosci. 23, 9246-9253 (2003).
- Jiang, S. A., Campusano, J. M., Su, H., O'Dowd, D. K. Drosophila mushroom body Kenyon cells generate spontaneous calcium transients mediated by PLTX-sensitive calcium channels. J. Neurophysiol. 94, 491-500 (2005).
- Campusano, J. M., Su, H., Jiang, S. A., Sicaeros, B., O'Dowd, D. K. nAChR-mediated calcium responses and plasticity in Drosophila Kenyon cells. Develop Neurobiol. 67, 1520-1532 (2007).
- Oh, H. -W., Campusano, J. M., Hilgenberg, L. G. W., Sun, X., Smith, M. A., O'Dowd, D. K. Ultrastructural analysis of chemical synapses and gap junctions between Drosophila brain neurons in culture. Develop Neurobiol. , (2007).
