늦은 단계 Drosophila Pupae의 두뇌에서 기본의 연결을 문화

Summary

이 동영상은 늦게 무대 Drosophila pupae의 두뇌에서 기본의 연결을 문화의 준비를 보여줍니다. 라이브 문화의 전망 Fura - 2를 사용하여 칼슘 수준의 neurite의 파생물 및 이미징을 보여줍니다.

Abstract

이 비디오에서는, 우리는 늦은 무대 Drosophila pupae의 두뇌에서 기본의 연결을 문화의 준비를 보여줍니다. 절차는 번데기 형성 후 70-78 시간에 동물의 두뇌의 제거와 함께 시작됩니다. 고립된 두뇌는 혈청이없는 성장 매체에 여러 세척 다음 papain의 짧은 부화 후 표시됩니다. coverslip에 대한 미디어의 5 UL 드롭의 각 두뇌의 기계적 분리의 과정을 그림입니다. 포스트 mitotic의 뉴런의 axons과 dendrites이 분리되는 동안 소마 근처에서 털을 깎으하지만 뉴런은 도금 몇 시간 이내에 프로세스를 생성하기 시작합니다. 이미지 2 일에서 살고 문화를 보여줍니다. 뉴런은 문화의 첫 번째 주 동안 프로세스를 정교로 진행합니다. 특정의 연결 인구는 같은 GFP 또는 RFP 같은 형광 마커의 조직 구체적인 표현을 드라이브에 GAL4 라인을 사용하는 문화에서 확인할 수 있습니다. 전체 셀 녹음은 교양 뉴런은 기능, 자발적으로 적극적인 cholinergic 및 GABAergic 시냅스를 형성 증명하고있다. 짧은 비디오 세그먼트는 교양 뉴런의 접시에 자발적인 칼슘 과도 및 니코틴 evoked 칼슘 반응을 모니터하기 위해 칼슘 표시기 색소로 Fura - 2를 사용하여 교양 뉴런의 칼슘 역학을 보여줍니다. 이러한 pupal 뇌 문화 유전 및 약리 도구 중앙 시냅스 형성과 기능에 영향을 내장하고 외부 요인을 식별하는 데 사용될 수있는 유용한 모델 시스템입니다.

Protocol

culturing의 하루 전에 준비 :

1. 멸균 해부 솔루션을 확인하십시오.
2. 멸균 DMEM 만들기 4 10 ML aliquots에 보관 ° C를 2 주 동안.
3. 1 개월 50 또는 100 μl aliquots에 살균 DDM2 보충 및 동결하십시오.
4. 코나 / laminin하십시오.
5. 외투 coverslips.
   옵션 : 최대 4 개월까지 냉동 살균 CNBM하고 저장하십시오.

culturing의 날에

나도 층류 흐름 후드의 효소 솔루션 (ES)를 준비

1. 15 ML의 원심 분리기 튜브의 솔루션 (DS)를 해부 5 ML 놔.
2. 0.6 ML eppendorf에 L - 시스테인의 0.8 MG를 저울질하고 DS 150 μl를 추가합니다. 결정들이 갈 때까지 최대 피펫 아래로.
3. DS / 5 ML의 DS에 시스테인 150 ML을 추가하고 잘 섞는다.
4. Papain 50 U을 (부대) 추가합니다.
5. 0.1 N 나 OH 7 ML을 추가하고 잘 섞는다. Solution은 30 분 이내에 삭제됩니다. 활성화되면.
6. 멸균 1.5 ML 스크류 캡 microfuge 관에 0.2 mm의 주사기 필터와 필터 효소 솔루션
   
   Papain : 5 ML의 DS 50 U를 원하십니까. 각 배치는 약간의 차이이므로, 얼마나 계산해야합니다 :
   37.3 MG / ML 및 28.3 U / MG
   37.3 X 28.3 = 1055.59 U / ML (1000 ML)
   50 U = 47.4 ML
   

II. DDM2 미디어 만들기

culturing의 당일 : DDM2를 만들기 위해 다음과 같은 보충제를 추가

DMEM의 10 ML은 culturing 전에 보충제를 추가합니다 :

1. 100μl 트랜스페린
2. 100μl Putrescine
3. 100μl 셀레늄
4. 100μl Progesterone
5. 50μl 인슐린
6. 10μl 20 Hydroxyecdysone

참고 : 계획 모두 문화 (각 두뇌 개인 35mm 페트리 접시에 하나 coverslip, 1.5 미디어 MS / 문화 도금)에 대한 충분한 DDM2 확인

단계 III - VI는 한 nonsterile 실험실 벤치에있을 수있는 45 분 이내에 완료해야합니다.

III. Pupae 콜렉션

1. 해부 현미경 유리병의 측면 10-15 pupae을 선택합니다.
2. 마른 35mm 페트리 접시의 뚜껑에 플레이스 pupae.

참고 : 우리가 일반적으로 번데기 형성 (APF) 이후 55-78시간 사이 pupae의 두뇌를 사용합니다. neurite 가지의 전반적인 수준이 가장 오래된 pupae에서 약간 낮은 상태에서 머리 캡슐이 붕괴하는 경향 때문에 이것은 젊은 pupae에서 두뇌를 해부하다하는 약간 어렵습니다. 캔턴 - S wildtype 스트레인에서 다음 단계가 다른 작은 안료와 약간 붉은 갈색 빛을 아르 색소 눈이 인정하고 있습니다.

IV. 해부 현미경으로 잘린

1. 플레이스 다음 페트리 접시의 뚜껑에 살균 해부 솔루션의 두 방울은 pupae 수 있습니다.
2. 부드럽게 왼손에 좋은 포셉로 단일 번데기를 개최하고 번데기의 앞쪽에 끝에있는 표피를 제거하려면 오른쪽에있는 1 CC의 주사기에 부착된 27 게이지 주사 바늘을 사용합니다.
3. 포셉와 약간 번데기를 당기 머리가 나온다으로 목을 자르다 27 게이지 바늘을 사용합니다.
4. 바늘이나 집게의 끝부분으로 솔루션을 해부의 드롭에 머리를 전송할 수 있습니다.
5. 당신은 한 방울의 10-15 고개를 때까지 반복합니다.

해부 현미경으로 머리에서 두뇌의 V. 제거

1. 각 손에 27 게이지 바늘로 1 CC의 주사기를 개최.
2. 코 당신과 머리 등의 표면 북쪽에 직면 있도록 솔루션을 해부의 드롭에있는 파리 머리의 위치를​​ 다음을 사용하십시오.
3. 머리를 아래로 핀과 등의 표면에 복부에서가는 오른쪽 눈에 슬릿을 수있는 권리 바늘을 사용하는 코에 왼쪽에 바늘을 삽입합니다.
4. 코의 지역 왼쪽 부근 오른쪽 바늘을 삽입하고 오른쪽 눈 속에있는 슬릿 방향으로 머리를 밀고, 부드럽게 왼쪽 눈 위에 표피를 놓으면 왼쪽 바늘을 사용합니다. 두뇌는 종종 광학 이오 모두 상대적으로 그대로, 오른쪽에있는 슬릿에서 등장한다가 없어요 역시 여전히 붙어 때때로 색소 안구 조직.
5. 새로운 멸균, 35mm 페트리 접시에 멸균 생리 해부 한 방울로 바늘과 전송의 뒤쪽에 머리를 밀어.
6. 각각의 유전자형에 대한 10-15 두뇌를 수집합니다.
   

VI. 광학 엽 (叶)의 제거 및 효소 처리

1. 각 손에 27 게이지 바늘로 1 CC의 주사기를 잡고 해부 솔루션의 드롭 중 하나를 작은 영역에있는 모든 두뇌를 수집하는 이들을 사용하여
2. 문화 나머지 조직은 중앙 두뇌 지역하므로 각 두뇌의 광 엽 (叶)을 제거하는 도구를 절단과 같은 주사기를 사용합니다.
3. 무균 papain 솔루션 1 ML를 포함 eppendorf 튜브에 하나의 유전자형의 모든 두뇌를 전송할 5 μl에서 설정 20 μl pipetman를 사용합니다.
4. 뇌는 60 RPM에서 회전 세트 10~15분에 대한 papain에 incubated.
5. 3 분 3,000 rpm으로 원심 분리기.
   

무균 층류 후드 안쪽 - 조직이 공기에 노출되어있는 모든 단계의 나머지 단계에 대한 층류 후드에서 수행되어야합니다.

VII. 세탁

1. 효소 솔루션을 제거하고 멸균 해부 솔루션으로 대체합니다.
2. 3 분 3,000 rpm으로 원심 분리기.
3. 무균 해부 솔루션으로 3 회 총 씻으십시오.
4. 해부 생리를 제거하고 DDM2로 바꿉니다.
5. 원심 분리기와 DDM2 2 회 총 씻으십시오.
6. 멸균 35mm 페트리 접시에 전송 두뇌와 미디어.
   

VIII. 해부 현미경으로 분쇄 및 도금

1. coverslip의 중심에 DDM2 5 UL 놓습니다.
2. 노란 팁과 DDM2이 드롭 1 머리를 전송합니다.
3. 현미경, 작은 조각 (<1 분 소요됩니다)에 두뇌를 주사위 27 게이지 바늘을 사용합니다.
4. 영상지도 아래, 큰 조각이 부드럽게 pipet의 일각에 빨려하고 중간에 다시 퇴학 수 있도록 좋은 지점으로 뽑아왔다 유리 pipet의 팁을 휴식. 우리는 100 μl 혈소판 모세관 유리 표준으로 입 흡입 튜브를 사용합니다.
   
   참고 : 미디어의 거품을 끌지 않기 위해 조심하고 당신이 경험적으로 사용할 수있는 최고의 크기 pipet을 결정해야합니다. 좋은 사람 당신이 무슨 30초 / 두뇌의 일부 개별 세포도 일부 대형 대단히 짧은 시간과 머리를 떼어 놓다 수 있습니다. 당신은 높은 전력이 볼 때, 뉴런의 약 10~20%는 여전히 남아있는 일부 프로세스를해야하고 여전히 일부 대형 대단히 짧은 시간있을 것입니다. 당신이 너무 많이 떼어 놓다면 모든 세포가 원형되며, 그들은 살아남지 못할 것이다 너무 많은 피해를 입었됩니다. 이 단계는 연습이 필요하고 신속하게 변경할 수있는 큰 표면 대 부피 비율과 DDM2의 드롭의 osmolality과 산도가 있기 때문에 신속하게 할 수 있어야합니다. 조직 최대한 빨리 CO ₂ 배양기에 배치해야합니다.
   
   
5. "유전자형, 날짜 및 시간"페트리 접시의 뚜껑에 작성합니다.
6. 100mm 배양 접시에있는 35mm 페트리 접시를 (서부 유럽 표준시 kimwipe)를 넣어 30 분 CO ₂ 배양기에서 쉬라 구.
7. DDM2 1.5 ML로 35mm의 요리를 홍수.
8. 5% CO ₂ 배양기 (23 ° C)에서 보육의 문화를 유지.
   
   참고 : 냉각 CO ₂ 배양기에 액세스할 수없는 경우, 표준 포유류의 조직 문화 배양기를 사용하고 중 23 시원한 공간과 더위에 넣어 ° C, 또는 실험실에 넣어 온도를 해제하고 사용 주변 주위 온도를 조절하기 위해 보육의 하단 트레이에 얼음.
   

IX. 수유 셀

1. CNBM/B27 : 1 일 (다음날)에서 3시 1분 DDM2를 만들기 위해 CNBM/B27 0.5 ML (에어컨 미디어)를 추가합니다.
2. CNBM/B27 : 데이에 5 3시 1분 DDM2 미디어 1 ML를 교체하십시오.
3. CNBM/B27 모든 4-5일 : 3시 1분 DDM2와 함께 먹이를 세포 보관하십시오.
   
   참고 : 문화가 아닌 시설의 연결 매체없이 재배하지만 뉴런 좀 더 깨지기 쉬운 표시 및 전기 생리학 실험에 사용하기 위해 더 어렵다 수 있습니다.

Discussion

그들이 neurites을 확장하고 기능적인 시냅스 연결을 형성 어디 배아 / 출생 후의 설치류 동물의 두뇌에서 수확 뉴런은 기본 세포 배양 재배하실 수 있습니다. 이러한 문화의 준비를위한 방법은 잘 구축하고 있으며 설치류의 연결을 문화의 연구 버렸네 형성과 기능의 조절 (뱅커와 고슬린, 1991)에 관련된 유전자와 환경 요인을 식별하는 중요한 역할을했습니다. 인류의 다양한 곤충 뉴런도 문화의 성장 수 있지만, 문화의 기능 시냅스 연결을 형성 표시된 유일한 곤충 뉴런은 Drosophila (Rohrbough 외, 2003)에서 있습니다. Neuroblasts 정의된 미디어 재배 중반 gastrula 단계 Drosophila의 배아는 전기 고르기 및 양식 기능, interneuronal 시냅스 연결 (; 리와오다 1999 년오다, 1995)입니다 뉴런을 일으키다 수확. 시냅스 형성과 우리가 늦은 단계 Drosophila (스와 및오다, 2003)의 머리에서 수확 및 culturing 뉴런이 동영상에 설명된 기술을 개발 성인 행동을 중재에 참여하는 것으로 알려져 뉴런의 기능을 조절 요소를 식별합니다. 이 절차의 핵심 기능 중 하나는 대신 collagenase 또는 전통적으로 곤충의 연결을 문화의 준비에 사용되는 다른 거친 효소 papain을 사용하는 것이었다. 생존 짧은 axonal 프로세스를 유지 dissociated 뉴런의 Papain 결과, neuritic 프로세스를 생성하고, 기능 interneuronal 시냅스 연결을 형성합니다. 버섯 신체 케년 세포를 포함하여 확인된 세포 집단에서 전체 음반은 억제가 GABA 수용체 (스와 및오다, 2003)을 중재하는 동안 문화에 빠른 흥분성의 시냅스 전달이 nAChRs에 의해 중재는 것을 보여줍니다. 최근 전자 현미경 분석 보여줍 그 성인 두뇌의 화학 및 전기 시냅스 (오, 외., 2007) 모두에 유사한 구조적 특징과 문화 양식 시냅스에서 신경. 비디오에 그림과 같이, 문화도 Fura - 2 칼슘 이미징 연구 의무가 있으며 우리는 케년 세포 cholinergic 뉴런 (티베트 동부 표준시를 포함하여 확인된 세포 집단에서 세포 내 칼슘 수준의 자연과 evoked 변화를 기본 세포 메커니즘을 조사하기 위해 이들을 사용한 알, 2005;. Campusano 외, 2007).. Drosophila에서 사용할 수있는 광범위한 유전자 도구 키트와 함께 문화 시스템은 중앙 버렸네의 구조, 기능, 및 소성의 본질과 외부 규제를 식별을위한 매우 유용한 도구를 제공합니다.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Concanavalin A		Sigma-Aldrich	C-2010	To 2.5 mL DS, add 25 mg Concanavalin A bottle. This is 10 mg/ml concentration.Make aliquots of 90 ul and store at -20 °C, no longer than 3 months.
Laminin		Sigma-Aldrich	L-2020	Add 1 mL DS to 1mg Laminin bottle. This is 0.5 mg/mL concentration.Make aliquots of 10 μL and store at -20 °C, no longer than 3 months.
Coverslips		Bellco Glass	1943-00012	12 mm glass coverslips
ConA + Laminin solution				Stock solution, from Con A stock and laminin stock, for coverslip coating: Add in 5 mL DS, 83.5 μL of ConA (167 μg/mL) and 8.35 μuL of Laminin (0.835 μg/mL). Mix. Make aliquots of 100 μL and store at -20 °C, not longer than a month.
Dissecting Solution	Buffer			For 500 ml: 400 ml Ultra filtered water + 25 ml Stock Solution A + 14 ml Stock Solution B + 3.0 g (33.3 mM) D (+)-Glucose (Sigma G-8270) + 7.5 g (43.8 mM) Sucrose (Sigma S-0389). Adjust pH to 7.4 with 1N NaOH (around 2 ml). Bring final volume to 500 ml with ultra filtered water. Decant into a clean glass bottle and autoclave. Label "Dissecting Solution" and store at 4?C.
Dissecting Solution	Buffer			For 500 ml: 400 ml Ultra filtered water + 25 ml Stock Solution A + 14 ml Stock Solution B + 3.0 g (33.3 mM) D (+)-Glucose (Sigma G-8270) + 7.5 g (43.8 mM) Sucrose (Sigma S-0389). Adjust pH to 7.4 with 1N NaOH (around 2 ml). Bring final volume to 500 ml with ultra filtered water. Decant into a clean glass bottle and autoclave. Label "Dissecting Solution" and store at 4?C.
Solution B: HEPES	Buffer	Sigma-Aldrich	H-3375	20.97g (9.9mM). Add ultra filtered water up to 200 ml. Mix until dissolve and bring final volume to 250 ml. Place in a clean bottle and autoclave. Label "Solution B" and store at 4 C.
Solution A	Buffer			For 500 ml: 80.0g (137 mM) NaCl (Sigma S-9625) + 4.0g (5.4mM) KCl (Sigma P-4504) + 0.24g (0.17mM) Na2HPO4 (Sigma S-0876) + 0.3g (0.22 mM) KH2PO4 (Sigma P-5379).Weigh out all ingredients and mix until dissolved with 400 ml ultra filtered water. Bring final volume to 500 ml. Place in a clean bottle and autoclave. Label "Solution A" and store at 4°C.
Coating Coverslips:Put autoclaved coverslips in a 60 mm petri dish.Pipet 5 ul of Con A/Laminin mix onto center of each coverslip.Place in 37 C incubator for 2 hours.Rinse 3x coverslips with 100 ul of autoclaved water each. Use vacuum attached to a sterile Pasteur pipet.During the last rinse, pick up the coverslip with forceps and dry both sides.Transfer the coverslip to a 35mm Petri dish.Store at room temperature for up to a month.