Culturas primárias neuronais do cérebro de Tarde Stage Drosophila pupas

Summary

Este vídeo demonstra a preparação de culturas primárias de neurônios do cérebro de final de estágio Drosophila pupas. Pontos de vista de culturas vivas mostram crescimento de neuritos e imagem dos níveis de cálcio usando Fura-2.

Abstract

Neste vídeo, demonstramos a preparação de culturas primárias de neurônios do cérebro de final de estágio Drosophila pupas. O procedimento começa com a remoção dos cérebros de animais em 70-78 horas após a formação pupário. Os cérebros isolados são mostrados após incubação em breve papaína seguido por várias lavagens em soro livre de meio de crescimento. O processo de dissociação mecânica de cada cérebro em uma queda de 5 ul de mídia em uma lamela é ilustrado. Os axônios e dendritos dos neurônios pós-mitóticas são cisalhado off perto da soma durante a dissociação, mas os neurônios começam a regenerar os processos dentro de algumas horas de placas. Imagens mostram culturas vivas em dois dias. Neurônios continuar a desenvolver processos durante a primeira semana de cultura. Populações neuronais específicas podem ser identificadas em cultura usando GAL4 linhas a dirigir expressão tecido específico de marcadores fluorescentes, como GFP ou RFP. Gravações de células inteiras têm demonstrado que os neurônios cultivados forma funcional, espontaneamente ativa sinapses colinérgicas e GABAérgica. Um segmento pequeno vídeo ilustra a dinâmica do cálcio nos neurônios cultivados usando Fura-2 como um corante indicador de cálcio para monitorar transientes de cálcio espontânea e nicotina respostas evocadas de cálcio em um prato de neurônios cultivados. Estas culturas cérebro pupal são um sistema modelo útil em que as ferramentas genéticas e farmacológicas podem ser usados ​​para identificar os fatores intrínsecos e extrínsecos que influenciam a formação ea função de sinapses central.

Protocol

Preparações antes do dia da cultura:

1. Fazer a solução de dissecar estéril.
2. Faça DMEM estéril e manter em alíquotas de 10 ml a 4 ° C por 2 semanas.
3. Tornar estéril DDM2 suplementos e congelar em 50 ou 100 mL alíquotas de 1 mês.
4. Faça ConA / laminina.
5. Lamínulas casaco.
   Opcional: Faça CNBM estéril e armazenar congelado por até 4 meses.

No dia da cultura

I. Preparar solução enzimática (ES), em capela de fluxo laminar

1. Coloque 5 ml de solução de dissecação (DS) em um tubo de centrífuga de 15 ml.
2. Pesar 0,8 mg de L-cisteína em um eppendorf 0,6 ml e adicionar 150 mL de DS. Pipeta para cima e para baixo até que os cristais são ido.
3. Adicione 150 ml de DS / Cisteína aos 5 DS ml e misture bem.
4. Adicionar 50 U (unidades) de papaína.
5. Adicionar 7 ml de 0,1 N Na OH e misture bem. Solução clara dentro de 30 min. quando ativado.
6. Solução enzimática de filtro com 0,2 milímetros filtro de seringa de 1,5 ml em um tubo de microcentrífuga estéril parafuso cap
   
   Papaína: Quer 50 U em 5 ml DS. Cada lote é um pouco diferente, por isso deve calcular quanto:
   37,3 mg / ml e 28,3 U / mg
   37,3 x 28,3 = 1055,59 U / ml (1000 ml)
   50 U = 47,4 ml
   

II. Faça DDM2 media

No dia da cultura: adicione os seguintes suplementos para fazer DDM2

A 10 ml de DMEM adicionar os suplementos, pouco antes de cultivo:

1. 100μl Transferrina
2. 100μl Putrescine
3. 100μl Selenium
4. Progesterona 100μl
5. Insulina 50μl
6. 10μl 20-Hydroxyecdysone

Nota: Faça o suficiente para todas as culturas DDM2 planejado (cada cérebro banhado em uma lamela em um único prato de 35 milímetros individuais Petri, 1,5 ms dos meios de comunicação / cultura)

Etapa III-VI pode estar em uma bancada de laboratório feito não estéreis e devem ser concluídas em 45 minutos ou menos.

III. Pupas Colecção

1. Selecione 15/10 pupas de lados do frasco com um microscópio de dissecação.
2. Pupas lugar na tampa de um prato de 35 milímetros seco Petri.

Nota: Nós usamos geralmente cérebros de pupas entre 55-78 horas após a formação pupário (APF). É ligeiramente mais difícil de dissecar o cérebro dos mais jovens pupas, as cápsulas cabeça tendem a entrar em colapso, enquanto o nível geral de crescimento de neuritos é ligeiramente mais baixa desde o mais velho pupas. Na cepa do tipo selvagem Canton-S, estes estágios são reconhecidos pelos olhos que são pigmentadas castanho claro a ligeiramente avermelhado, com pouco pigmento em outros lugares.

IV. Decapitação sob microscópio de dissecação

1. Coloque duas gotas de solução estéril em dissecar tampa da placa de Petri, ao lado de pupas.
2. Suavemente realizar uma única pupa com uma pinça fina na mão esquerda e usar um medidor de 27 agulha da seringa conectada a uma seringa cc 1 na mão direita para remover a cutícula na extremidade anterior de pupa.
3. Squeeze pupa ligeiramente com uma pinça e emerge como chefe use agulha de calibre 27 para cortar o pescoço.
4. Com a ponta da agulha ou a pinça, a transferência de cabeça para queda de dissecar solução.
5. Repita até que você tenha 10-15 cabeças em uma única gota.

V. A remoção do cérebro de cabeça sob microscópio de dissecação

1. Em cada mão segurar uma seringa de 1 cc com uma agulha de calibre 27.
2. Use-os para a posição da cabeça voar em uma gota de solução para dissecar a probóscide é voltado para você ea superfície dorsal da cabeça é o norte.
3. Inserir a agulha esquerda para a probóscide para fixar a cabeça para baixo e use a agulha direita para fazer uma fenda no olho direito que vai da superfície ventral para dorsal.
4. Inserir a agulha direita perto do lado esquerdo na região da tromba e depois usar a agulha esquerda para a acione a cutícula sobre o olho esquerdo, empurrando o cérebro na direção da fenda no olho direito. O cérebro deve emergir da fenda do lado direito, relativamente intacta, muitas vezes com ambos eis ópticabes ainda ligado e por vezes, o tecido ocular, bem pigmentada.
5. Empurrar o cérebro na parte traseira da agulha e transfira para uma gota de solução salina estéril em dissecar um novo estéril 35 mm, placa de Petri.
6. Coletar 15/10 cérebros para cada genótipo.
   

VI. Remoção dos lobos óptica e tratamento enzimático

1. Em cada mão segurar uma seringa de 1 cc com uma agulha de calibre 27 e usá-los para coletar todos os cérebros em uma pequena área da gota de solução de dissecação
2. Use seringas como ferramentas de corte para remover os lobos ótica de cada um cérebro de modo que o tecido remanescente para a cultura é a região do cérebro central.
3. Use um Pipetman 20 l, fixado em 5 mL, para transferir todos os cérebros de um genótipo único para um tubo eppendorf contendo 1 ml de solução de papaína estéril.
4. Cérebros incubadas em papaína por 10-15 minutos em um conjunto rotador em 60 rpm.
5. Centrifugar a 3000 rpm por 3 minutos.
   

Dentro capô estéril de fluxo laminar - todas as etapas onde o tecido é exposto ao ar deve ser feito em capela de fluxo laminar para as etapas restantes.

VII. Lavagem

1. Remover e substituir solução enzimática com solução estéril de dissecação.
2. Centrifugar a 3000 rpm por 3 minutos.
3. Lave com uma solução estéril dissecar um total de 3 vezes.
4. Remover salina dissecar e substituir com DDM2.
5. Centrifugar e lavar um total de 2 vezes com DDM2.
6. Transferência de cérebros e de mídia para um prato de 35 milímetros estéril Petri.
   

VIII. Trituração e Plating sob microscópio de dissecação

1. Lugar de 5 ul DDM2 no centro de uma lamela.
2. Transferência de um cérebro para essa queda de DDM2 com uma ponta amarela.
3. Sob o microscópio, use 27 agulhas de dados até o cérebro em pedaços pequenos (devem ter <1 minuto).
4. Sob a orientação visual, quebrar a ponta de uma pipeta de vidro que foi puxado para uma ponta fina para que as peças maiores podem ser delicadamente sugado para a ponta da pipeta e expulsos de volta para o meio. Usamos tubos de boca de sucção que vêm de fábrica com 100 mL de vidro hematócrito capilar.
   
   Nota: Tome cuidado para não ficar bolhas na mídia e você precisará determinar empiricamente a pipeta melhor tamanho para usar. Bons permitem dissociar o cérebro com algumas células individuais e ainda algumas grandes aglomerações, em cerca de 30 segundos / cérebro. Quando você olha para estes em maior potência, aproximadamente 10-20% dos neurônios ainda deve ter alguns processos remanescentes e ainda haverá alguns grandes aglomerações. Se você dissociar demais, então todas as células serão rodada e terão sofrido danos tanto que eles não vão sobreviver. Esta etapa requer prática e deve ser feito rapidamente, pois há uma relação superfície-volume grande ea osmolalidade e pH da gota de DDM2 podem mudar rapidamente. Tecido precisa ser colocado em incubadora de CO ₂ o mais rápido possível.
   
   
5. Escrever sobre a tampa placa de Petri: "O genótipo, data e hora".
6. Coloque a placa de Petri 35 milímetros em um prato de 100 milímetros de Petri (com kimwipe molhado) e deixe se instalar na incubadora _de CO ₂ por 30 min.
7. Inundar o prato de 35 mm com 1,5 ml de DDM2.
8. Manter culturas na incubadora a 5% incubadora de CO ₂ (23 ° C).
   
   Nota: Se você não tem acesso a um resfriamento incubadora de CO _2, use um padrão de cultura de tecidos de mamíferos incubadora e quer colocá-lo em uma sala fria e calor a 23 ° C, ou colocar no laboratório, desligue temp, e usar gelo em uma bandeja na parte inferior da incubadora para regular a temperatura em torno de ambiente.
   

IX. Células de alimentação

1. No 1 º dia (dia seguinte), adicionar 0,5 ml de CNBM/B27 (Media condicionado) para fazer 03:01 DDM2: CNBM/B27.
2. No dia 5 substituir 1 ml de mídia para 03:01 DDM2: CNBM/B27.
3. Manter as células de alimentação com 03:01 DDM2: CNBM/B27 cada 4-5 dias.
   
   Nota: As culturas podem ser cultivadas sem a mídia não-neuronal condicionado, mas os neurônios parecem um pouco mais frágil e são mais difíceis para uso em experimentos de eletrofisiologia.

Discussion

Neurônios colhidos os cérebros de roedores embrionárias / pós-natal podem ser cultivadas em cultura de células primária onde se estendem neurites e formam conexões sinápticas funcionais. Métodos para a preparação dessas culturas estão bem estabelecidas e estudos em culturas de roedores neuronal têm desempenhado um papel fundamental na identificação de genes e fatores ambientais envolvidos na regulação da formação de sinapses e função (Banker e Goslin, 1991). Enquanto os neurônios do inseto a partir de uma variedade de espécies também podem ser cultivadas em cultura, os neurônios só inseto mostrado para formar conexões sinápticas funcionais na cultura são de Drosophila (Rohrbough et al, 2003). Neuroblastos colhidas meados de gástrula embriões em estágio Drosophila cultivadas em meios de comunicação definida dar origem a neurônios que são eletricamente excitáveis ​​e forma funcional, interneuronal conexões sinápticas (O'Dowd, 1995; Lee e O'Dowd, 1999). Identificar fatores que regulam a forma e função sináptica nos neurônios conhecido por estar envolvido na mediação de comportamentos de adultos que desenvolveu a técnica ilustrada neste vídeo para os neurônios colheita e cultivo de cérebros de final de estágio Drosophila (Su e O'Dowd, 2003). Uma das principais características deste procedimento foi a utilização papaína, em vez de colagenase e outras enzimas dura tradicionalmente usado na preparação de insetos culturas neuronal. Resultados papaína em neurônios dissociados retenção curto processos axonal que sobreviver, regenerar processos neuríticas, e forma funcional interneuronal conexões sinápticas. Gravações inteiro em populações de células identificadas, incluindo as células de cogumelos corpo Kenyon, mostram que a transmissão sináptica excitatória rápida nas culturas é mediada por nAChRs enquanto a inibição é mediada receptores GABA (Su e O'Dowd, 2003). Nossa análise microscópica eletrônica recente demonstra que os neurônios nas sinapses formulário cultura com características estruturais que são semelhantes para ambas as químicas e sinapses elétricas no cérebro adulto (Oh et al., 2007). Como ilustrado no vídeo, as culturas também são passíveis de Fura-2 estudos de imagem de cálcio e temos usado estes para investigar os mecanismos celulares subjacentes mudanças espontâneas e evocadas nos níveis de cálcio intracelular nas populações de células, incluindo células identificadas Kenyon e neurônios colinérgicos (Jiang et al, 2005;. Campusano et al, 2007).. Com o kit de ferramentas extensa genética disponível em Drosophila este sistema de cultura fornece uma ferramenta muito útil para identificar os reguladores intrínsecos e extrínsecos de estrutura sinapse central, função e plasticidade.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Concanavalin A		Sigma-Aldrich	C-2010	To 2.5 mL DS, add 25 mg Concanavalin A bottle. This is 10 mg/ml concentration.Make aliquots of 90 ul and store at -20 °C, no longer than 3 months.
Laminin		Sigma-Aldrich	L-2020	Add 1 mL DS to 1mg Laminin bottle. This is 0.5 mg/mL concentration.Make aliquots of 10 μL and store at -20 °C, no longer than 3 months.
Coverslips		Bellco Glass	1943-00012	12 mm glass coverslips
ConA + Laminin solution				Stock solution, from Con A stock and laminin stock, for coverslip coating: Add in 5 mL DS, 83.5 μL of ConA (167 μg/mL) and 8.35 μuL of Laminin (0.835 μg/mL). Mix. Make aliquots of 100 μL and store at -20 °C, not longer than a month.
Dissecting Solution	Buffer			For 500 ml: 400 ml Ultra filtered water + 25 ml Stock Solution A + 14 ml Stock Solution B + 3.0 g (33.3 mM) D (+)-Glucose (Sigma G-8270) + 7.5 g (43.8 mM) Sucrose (Sigma S-0389). Adjust pH to 7.4 with 1N NaOH (around 2 ml). Bring final volume to 500 ml with ultra filtered water. Decant into a clean glass bottle and autoclave. Label "Dissecting Solution" and store at 4?C.
Dissecting Solution	Buffer			For 500 ml: 400 ml Ultra filtered water + 25 ml Stock Solution A + 14 ml Stock Solution B + 3.0 g (33.3 mM) D (+)-Glucose (Sigma G-8270) + 7.5 g (43.8 mM) Sucrose (Sigma S-0389). Adjust pH to 7.4 with 1N NaOH (around 2 ml). Bring final volume to 500 ml with ultra filtered water. Decant into a clean glass bottle and autoclave. Label "Dissecting Solution" and store at 4?C.
Solution B: HEPES	Buffer	Sigma-Aldrich	H-3375	20.97g (9.9mM). Add ultra filtered water up to 200 ml. Mix until dissolve and bring final volume to 250 ml. Place in a clean bottle and autoclave. Label "Solution B" and store at 4 C.
Solution A	Buffer			For 500 ml: 80.0g (137 mM) NaCl (Sigma S-9625) + 4.0g (5.4mM) KCl (Sigma P-4504) + 0.24g (0.17mM) Na2HPO4 (Sigma S-0876) + 0.3g (0.22 mM) KH2PO4 (Sigma P-5379).Weigh out all ingredients and mix until dissolved with 400 ml ultra filtered water. Bring final volume to 500 ml. Place in a clean bottle and autoclave. Label "Solution A" and store at 4°C.
Coating Coverslips:Put autoclaved coverslips in a 60 mm petri dish.Pipet 5 ul of Con A/Laminin mix onto center of each coverslip.Place in 37 C incubator for 2 hours.Rinse 3x coverslips with 100 ul of autoclaved water each. Use vacuum attached to a sterile Pasteur pipet.During the last rinse, pick up the coverslip with forceps and dry both sides.Transfer the coverslip to a 35mm Petri dish.Store at room temperature for up to a month.