Summary
Это видео демонстрирует подготовки первичных нейронов культур из мозга дрозофилы поздней стадии куколки. Просмотров живых культур показывают результат аксонов и отображения уровня кальция использованием Фура-2.
Abstract
В этом видео, мы демонстрируем подготовки первичных нейронов культур из мозга дрозофилы поздней стадии куколки. Процедура начинается с удаления из мозга животных на 70-78 часов после пупария образования. Изолированные мозги показываются после краткой инкубации в папаин последовало несколько моет в бессывороточной ростовой среды. Процесс механической диссоциации каждой мозга в 5 мкл капли СМИ на покровное иллюстрируется. Аксонов и дендритов после митотического нейроны sheered с рядом сома в период раздробленности, но нейроны начинают восстанавливать процессы в течение нескольких часов обшивки. Изображения показывают живые культуры на 2 дня. Нейроны продолжить разработку процессов в течение первой недели в культуре. Конкретные нейронные популяции могут быть идентифицированы в культуре использованием GAL4 линии ездить ткани конкретное выражение флуоресцентные маркеры, такие как GFP и RFP. Всего записей ячейки продемонстрировали культурные нейроны формируют функциональные, спонтанно активных холинергической и ГАМК-синапсы. Короткий сегмент видео иллюстрирует динамику кальция в нейроны культурный использованием Фура-2 в качестве красителя показатель кальция для контроля спонтанной переходных кальция и никотина вызвала ответы кальция в блюдо культурный нейронов. Эти куколки культур мозга полезной модели системы, в которой генетические и фармакологические средства могут быть использованы для определения внутренних и внешних факторов, которые влияют на формирование и функции центральных синапсов.
Protocol
Подготовка до дня культивирования:
- Сделать стерильной рассекает решение.
- Сделать стерильной DMEM и храните в 10 мл аликвот при 4 ° С в течение 2 недель.
- Сделать стерильной DDM2 добавки и заморозить в 50 или 100 мкл аликвоты в течение 1 месяца.
- Сделать ConA / ламинин.
- Пальто покровные.
Дополнительно: Сделать стерильной CNBM и хранить замороженными до 4 месяцев.
В день культивирования
I. Подготовка раствора фермента (ES) в ламинарном потоке капот
- Положите 5 мл рассекает решение (DS) в 15 мл центрифужную пробирку.
- Взвесить 0,8 мг L-цистеин в 0,6 мл Eppendorf и добавить 150 мкл DS. Внесите вверх и вниз, пока кристаллы не ушли.
- Добавить 150 мл DS / цистеина в 5 мл DS и хорошо перемешать.
- Добавить 50 U (единиц) папаин.
- Добавить 7 мл 0,1 N Na ОН и хорошо перемешать. Решение будет ясно в течение 30 мин. при активации.
- Фильтры решение фермента с 0,2 мм шприц фильтр в стерильный 1,5 мл винт трубки микроцентрифужную крышкой
Папаин: Хотите 50 ЕД в 5 мл DS. Каждая партия несколько отличается, поэтому необходимо рассчитать, сколько:
37,3 мг / мл и 28,3 ед / мг
37,3 х 28,3 = 1055,59 ед / мл (1000 мл)
50 U = 47,4 мл
II. Сделать DDM2 СМИ
В день культивирования: добавить следующие дополнения, чтобы сделать DDM2
К 10 мл DMEM добавить добавки, как раз перед культивирования:
- 100 мкл трансферрина
- 100 мкл путресцин
- 100 мкл Селен
- 100 мкл Прогестерон
- 50 мкл инсулина
- 10 мкл 20-гидроксиэкдизона
Примечание: достаточно DDM2 для всех культур запланированных (каждый мозга высевали на одном покровное в отдельных 35 мм блюдо Петри, 1,5 мс СМИ / культура)
Шаг III-VI может быть сделано нестерильных скамейке лаборатории и должен быть завершен в течение 45 минут или меньше.
III. Куколки коллекции
- Выберите 10-15 куколки из сторон флакон под рассекает микроскопом.
- Место куколки в крышке сухой 35 мм блюдо Петри.
Примечание: Мы обычно используем мозг из куколок между 55-78 часов после пупария образования (НПФ). Это немного труднее вскрыть из мозга от младшего куколки с головой капсулы имеют тенденцию к краху, в то время как общий уровень аксонов несколько ниже из старейших куколок. В Canton-S штамм дикого типа, эти этапы признаны пигментированные глаза, светло-коричневые или слегка красноватый, с небольшим пигмента в другом месте.
IV. Обезглавливание при вскрытии микроскопом
- Место две капли стерильного рассекает решение в крышку чашки Петри, рядом с куколками.
- Аккуратно прижмите одну куколку с тонкими щипцами в левой руке и использовать 27 калибр иглы шприца прилагается к 1 мл шприц в правую руку, чтобы удалить кутикулу на переднем конце тела куколки.
- Сожмите куколки слегка щипцами и головой, как возникает использовать 27 иглы разорвать шею.
- С кончика иглы или пинцета, передача головы до капли рассекает решение.
- Повторяйте, пока у вас есть 10-15 голов в одной капли.
В. Удаление мозг от головы под микроскопом рассекает
- В каждой руке держать 1 мл шприц с иглой 27.
- Используйте их, чтобы положение лететь головой в капле рассекает решения, чтобы хоботок стоит перед вами и спинной поверхности головы на север.
- Вставьте левую иглу в хоботок, чтобы прикрепить голову вниз и правой иглы, чтобы сделать щель в правый глаз, который идет от брюшной части спинной поверхности.
- Вставьте правую иглу рядом с левой в области хоботка, а затем использовать левую спицу, чтобы мягко подавляют кутикулы над левым глазом, подталкивая мозг к щели в правый глаз. Мозг должен выйти из щели на правом, относительно нетронутыми, часто с обеих оптических сеБес еще привязаны, а иногда пигментированные ткани глаза, а также.
- Нажмите мозга на спину иглу и трансфер в каплю стерильного физиологического раствора в рассекает новые стерильные, 35 мм блюдо Петри.
- Сбор 10-15 мозг для каждого генотипа.
VI. Удаление оптических долях и обработки ферментом
- В каждой руке держать 1 мл шприц с иглой 27 и использовать их, чтобы собрать все мозги в одном небольшом участке капли рассекает решение
- Использование шприцев в качестве режущего инструмента для удаления зрительных долях мозга от каждого так ткани оставшихся для культуры центральной области мозга.
- Используйте 20 мкл pipetman, заход в 5 мкл, чтобы передать все мозги одного генотипа к трубке Эппендорф, содержащий 1 мл стерильного раствора папаин.
- Мозги инкубировали в папаин в течение 10-15 минут на ротатор установлен на уровне 60 оборотов в минуту.
- Центрифуга при 3000 оборотов в минуту в течение 3 минут.
Внутри стерильной ламинарном боксе - все шаги, где ткань подвергается воздействию воздуха должно быть сделано в ламинарный поток капот для оставшихся шагов.
VII. Мытье
- Удалить ферментный раствор и заменить стерильными рассекает решение.
- Центрифуга при 3000 оборотов в минуту в течение 3 минут.
- Промыть стерильной рассекает решение общей сложности 3 раза.
- Удалить рассекает засоленных и заменить DDM2.
- Центрифуга и мыть всего 2 раза с DDM2.
- Передача мозги и СМИ, чтобы стерильные 35 мм блюдо Петри.
VIII. Растирание и покрытие под микроскопом рассекает
- Место 5 мкл DDM2 в центре покровное.
- Передача 1 мозгу эту каплю DDM2 с желтым кончиком.
- Под микроскопом, использовать 27 игл колеи на кости до мозга на мелкие кусочки (если взять <1 минуты).
- Под визуальным руководством, сломать кончик стеклянной пипетки, которая тянется к тонкий момент, так что большие куски можно осторожно засасывается в кончике пипетки и выслан обратно в среду. Мы используем рот всасывания труб, которые поставляются с 100 мкл гематокрита капиллярное стекла.
Примечание: Будьте осторожны, чтобы не получить пузырьков в средствах массовой информации и вам необходимо эмпирически определить оптимальный размер пипетки в использовании. Хорошие позволяют отделить мозг с отдельных клеток и еще некоторые крупные комки, приблизительно через 30 секунд / мозга. Когда вы смотрите на эти при более высокой мощности, примерно 10-20% нейронов должна все еще есть некоторые процессы оставшихся и еще будет несколько больших комков. Если вы диссоциируют слишком много, то все клетки будут круглые и они будут иметь устойчивый так много вреда они не выживут. Этот шаг требует практики и должно быть сделано быстро, так как существует большое отношение поверхности к объему и осмотического давления и рН капли DDM2 может быстро измениться. Ткань должна быть помещена в CO 2 инкубаторе как можно быстрее. - Напишите на крышке чашки Петри: «Генотип, дата и время".
- Положите 35 мм чашки Петри в 100 мм блюдо Петри (с мокрой kimwipe), а поселиться в CO 2 инкубаторе в течение 30 мин.
- Потоп 35 мм блюдо с 1,5 мл DDM2.
- Держите культур в инкубаторе при 5% СО 2 инкубатора (23 ° С).
Примечание: Если у вас нет доступа к охлаждению CO 2 инкубатора, использование стандартных тканей млекопитающих культуры инкубатор и либо поместить его в прохладном помещении и нагреть до 23 ° C, или положить в лаборатории, выключите темп, и использовать льда в лоток в нижней части инкубатора регулировать темп вокруг окружающей среды.
IX. Кормление Клетки
- На День 1 (следующий день), добавить 0,5 мл CNBM/B27 (условные СМИ), чтобы сделать 3:01 DDM2: CNBM/B27.
- На 5-й день заменить 1 мл среды для 3:01 DDM2: CNBM/B27.
- Продолжайте кормление клеток с 3:01 DDM2: CNBM/B27 каждые 4-5 дней.
Примечание: культур можно выращивать без не-нейронных кондиционированной среде, но нейроны появляются чуть более хрупкими и более трудны для использования в экспериментах электрофизиологии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Нейроны найденным на мозг эмбриональных / послеродовой грызуны могут быть выращены в первичной культуре клеток, где они распространяются невриты и форма функциональной синаптических связей. Методы подготовки этих культур, хорошо известны и учится в грызунах нейронных культур сыграли решающую роль в идентификации генов и экологических факторов, участвующих в регуляции формирование синапса и функция (банкир и Гослин, 1991). Хотя насекомых нейронов из различных видов также может быть выращен в культуре, только нейроны насекомых показано, формируют функциональные синаптических связей в культуре от дрозофилы (Rohrbough и др., 2003). Нейробластов собрано середины гаструлы дрозофилы эмбрионов, выращенных в питательных средах с определенным привести к нейронам, которые являются электрически возбудимыми и форма функциональной, межнейронных синаптических связей (О'Дауд, 1995; Ли и О'Дауд, 1999). Для выявления факторов, которые регулируют синаптическую формы и функции в нейронах, как известно, участвует в качестве посредника взрослого поведения, мы разработали технику показано в этом видео для уборки и выращивания нейронов из мозгов поздней стадии дрозофилы (Су и О'Дауд, 2003). Одной из ключевых особенностей этой процедуры заключается в использовании папаин, вместо того, коллагеназа или другие агрессивные ферменты, которые традиционно используются в подготовке насекомых нейронных культур. Папаин результатов в диссоциированных нейронов сохраняя короткое аксонального процессы, которые выживают, регенерируют neuritic процессы и формы функциональных межнейронных синаптических связей. Всего записей в определенных клеточных популяций, в том числе грибов тела Кеньон клеток, показали, что быстрые возбуждающие синаптической передачи в культуре опосредуется nAChRs в то время как торможение опосредуется ГАМК рецепторы (Су и О'Дауд, 2003). Наши недавние электронно-микроскопического анализа показывают, что нейроны в синапсах культуры форму с структурными особенностями, которые похожи на химических и электрических синапсов в мозгу взрослого (О соавт., 2007). Как показано на видео, культуры, также поддаются Фура-2 исследования кальция изображений, и мы использовали эти исследовать механизмы, лежащие сотовой спонтанных и вызванных изменениями внутриклеточного уровня кальция в определенных клеточных популяций в том числе Кеньон клеток и холинергических нейронов (Jiang и др. др., 2005;. Campusano и др., 2007).. При обширных генетических набор инструментов доступен в дрозофилы этой культуры система обеспечивает очень полезным инструментом для выявления внутренних и внешних регуляторов центральной структуры синапсов, функции и пластичность.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана NIH грант NS27501 к DKOD. Дополнительная поддержка для этой работы был предоставлен грант на UC Irvine в поддержку DKOD в рамках Программы профессор HHMI.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Concanavalin A | Sigma-Aldrich | C-2010 | To 2.5 mL DS, add 25 mg Concanavalin A bottle. This is 10 mg/ml concentration.Make aliquots of 90 ul and store at -20 °C, no longer than 3 months. | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L-2020 | Add 1 mL DS to 1mg Laminin bottle. This is 0.5 mg/mL concentration.Make aliquots of 10 μL and store at -20 °C, no longer than 3 months. | |
| Coverslips | Bellco Glass | 1943-00012 | 12 mm glass coverslips | |
| ConA + Laminin solution | Stock solution, from Con A stock and laminin stock, for coverslip coating: Add in 5 mL DS, 83.5 μL of ConA (167 μg/mL) and 8.35 μuL of Laminin (0.835 μg/mL). Mix. Make aliquots of 100 μL and store at -20 °C, not longer than a month. | |||
| Dissecting Solution | Buffer | For 500 ml: 400 ml Ultra filtered water + 25 ml Stock Solution A + 14 ml Stock Solution B + 3.0 g (33.3 mM) D (+)-Glucose (Sigma G-8270) + 7.5 g (43.8 mM) Sucrose (Sigma S-0389). Adjust pH to 7.4 with 1N NaOH (around 2 ml). Bring final volume to 500 ml with ultra filtered water. Decant into a clean glass bottle and autoclave. Label "Dissecting Solution" and store at 4?C. | ||
| Dissecting Solution | Buffer | For 500 ml: 400 ml Ultra filtered water + 25 ml Stock Solution A + 14 ml Stock Solution B + 3.0 g (33.3 mM) D (+)-Glucose (Sigma G-8270) + 7.5 g (43.8 mM) Sucrose (Sigma S-0389). Adjust pH to 7.4 with 1N NaOH (around 2 ml). Bring final volume to 500 ml with ultra filtered water. Decant into a clean glass bottle and autoclave. Label "Dissecting Solution" and store at 4?C. | ||
| Solution B: HEPES | Buffer | Sigma-Aldrich | H-3375 | 20.97g (9.9mM). Add ultra filtered water up to 200 ml. Mix until dissolve and bring final volume to 250 ml. Place in a clean bottle and autoclave. Label "Solution B" and store at 4 C. |
| Solution A | Buffer | For 500 ml: 80.0g (137 mM) NaCl (Sigma S-9625) + 4.0g (5.4mM) KCl (Sigma P-4504) + 0.24g (0.17mM) Na2HPO4 (Sigma S-0876) + 0.3g (0.22 mM) KH2PO4 (Sigma P-5379).Weigh out all ingredients and mix until dissolved with 400 ml ultra filtered water. Bring final volume to 500 ml. Place in a clean bottle and autoclave. Label "Solution A" and store at 4°C. | ||
| Coating Coverslips:Put autoclaved coverslips in a 60 mm petri dish.Pipet 5 ul of Con A/Laminin mix onto center of each coverslip.Place in 37 C incubator for 2 hours.Rinse 3x coverslips with 100 ul of autoclaved water each. Use vacuum attached to a sterile Pasteur pipet.During the last rinse, pick up the coverslip with forceps and dry both sides.Transfer the coverslip to a 35mm Petri dish.Store at room temperature for up to a month. | ||||
References
- Culturing Nerve Cells. Banker, G., Goslin, K. , MIT Press. Cambridge. (1991).
- Rohrbough, J., O'Dowd, D. K., Baines, R. A., Broadie, K. Cellular bases of behavioral plasticity: Establishing and Modifying synaptic circuits in the Drosophila Genetic System. J. Neurobiol. 54, 254-271 (2003).
- O'Dowd, D. K. Voltage-gated currents and firing properties of embryonic Drosophila neurons grown in a chemically defined medium. J. Neurobiol. 27, 113-126 (1995).
- Lee, D., O'Dowd, D. K. Fast excitatory synaptic transmission mediated by nAChR in cultured Drosophila neurons. J. Neurosci. 19, 5311-5321 (1999).
- Su, H., O'Dowd, D. K. Fast synaptic currents in Drosophila mushroom body Kenyon cells are mediated by alpha-bungarotoxin-sensitive nAChRs and picrotoxin-sensitive GABA receptors. J. Neurosci. 23, 9246-9253 (2003).
- Jiang, S. A., Campusano, J. M., Su, H., O'Dowd, D. K. Drosophila mushroom body Kenyon cells generate spontaneous calcium transients mediated by PLTX-sensitive calcium channels. J. Neurophysiol. 94, 491-500 (2005).
- Campusano, J. M., Su, H., Jiang, S. A., Sicaeros, B., O'Dowd, D. K. nAChR-mediated calcium responses and plasticity in Drosophila Kenyon cells. Develop Neurobiol. 67, 1520-1532 (2007).
- Oh, H. -W., Campusano, J. M., Hilgenberg, L. G. W., Sun, X., Smith, M. A., O'Dowd, D. K. Ultrastructural analysis of chemical synapses and gap junctions between Drosophila brain neurons in culture. Develop Neurobiol. , (2007).
