Grande Escala Telas de Bibliotecas metagenomic

Summary

Abstract

Metagenomic bibliotecas fragmentos contíguos grande arquivo de seqüências genômicas de microrganismos de cultivo sem a necessidade de prévio. Gerando um procedimento simplificado para a criação de bibliotecas e triagem metagenomic é, portanto, útil para eficiente de alto rendimento investigações sobre as propriedades genéticas e metabólicas dos agenciamentos microbiana inculta. Aqui, protocolos de chave são apresentados em vídeo, o que propomos é o formato mais útil para descrever com precisão um longo processo que depende alternadamente instrumentação robótica e intervenções (humano) manual. Primeiro, nós empregada robótica para detectar clones biblioteca para as membranas de alta densidade macroarray, cada um dos quais pode conter colônias duplicar 20-4 biblioteca placas de 384 poços. Automação é essencial para este procedimento não só quanto à precisão e velocidade, mas também devido à miniaturização de escala necessária para atender o grande número de clones de biblioteca em alta densidade arranjos espaciais. Uma vez gerado, o próximo demonstrou como as membranas macroarray podem ser selecionados para genes de interesse usando versões modificadas de protocolos padrão para rotulagem sonda, hibridação da membrana e detecção do sinal. Complementou-se o demonstração visual desses procedimentos com descrição escrita pormenorizada das etapas envolvidas e os materiais necessários, os quais estão disponíveis on-line ao lado do vídeo.

Protocol

1. Processo de hibridização

Um tubo de hibridização terá 1 ou 2 membranas (tamanho 22 por 22 cm). Use 50 ml de mistura de hibridização e 0,5 mg de DNA sonda (10 concentração ng / ml final) por tubo de hibridização. Para melhores resultados, use gel de DNA purificado como sonda. Se ampliação preparação da sonda, aumentar o número de tubos em vez de aumentar a quantidade de reagentes por tubo.

Sonda preparação (0,5 mg DNA):

1. Diluir 15 mL de cross-linker solução com 60 mL de água.
2. Diluir DNA a 10 ng / mL com água a 50 mL de volume total em um microtubo com tampa de rosca.
3. Desnaturar DNA por 5 minutos em água fervente.
4. Transferir rapidamente para o gelo e deixe esfriar por 5 min. Girar por alguns instantes.
5. Adicionar 50 ul de tampão de reação e misture delicadamente.
6. Adicionar 10 ml de reagente de rotulagem e misture delicadamente.
7. Adicionar 50 ul da solução cross-linker diluída a partir do passo 1 e misture delicadamente. Vortex suavemente e girar rapidamente.
8. Incubar a 37 ° C por 30 min.
9. Manter em gelo por até 2 h ou adicionar um volume igual de 100% de glicerol e armazenar a -20 ° C.
   
   Nota: Utilize a água fornecida com o kit. Manter todos os reagentes no gelo, salvo indicação contrária.

Preparação de membrana e hibridização

1. Pré-aqueça 50 ml de tampão de hibridação e tubo de hibridação a 60 ° C.
2. Adicione o tampão de hibridação para o tubo de hibridização. Roll-up de membrana (s) e adicionar ao tubo de hibridização. (Se a adição de 2 membranas por tubo, primeiro rolo de uma membrana completamente, então arregaçar a membrana outros em cima na mesma direção.)
3. Incube o tubo de hibridação a 60 ° C por pelo menos ½ h. (Certifique-se de membrana (s) ficar encharcado completamente.)
4. Transferência de cerca de 1 ml de tampão de hibridação com uma pipeta longo do tubo de hibridização para o tubo contendo a sonda marcada. Vortex suavemente e girar rapidamente. Transfira a mistura de volta ao tubo de hibridização.
5. Incubar a 60 ° C durante a noite.
   
   Nota: Use uma pinça e luvas ao manusear membranas. Misture o conteúdo dos tubos de hibridização delicadamente, pois a agitação excessiva fará com que a formação permanente de espuma indesejável. Membranas devem ser adicionados em condições molhadas; mergulhar em tampão de hibridação ou água se necessário e drenar o excesso de líquido antes de acrescentar.

2. Procedimento de detecção

Membranas de lavar

1. Pré-aqueça o tampão de lavagem principal a 60 ° C. (Use o forno microondas e / ou placa de aquecimento.)
2. Se houver 2 membranas em um tubo de hibridização, a transferência de uma membrana para um ambiente limpo, pré-aquecido tubo de hibridização, vazio.
3. Brevemente lavar tubo de hibridização com cerca de 50 ml de tampão de lavagem primária.
4. Adicionar cerca de 100 ml de tampão de lavagem primária para tubo de hibridização e incubar a 60 ° C por 10 min.
5. Repita o passo 3 e 4.
6. Transferência de membrana para lavagem de contentores e incubar com pelo menos 250 ml de tampão de lavagem secundária em temperatura ambiente por 5 min.
7. Repita a etapa 6.
   
   Nota: As membranas podem ser mantidos no tampão de lavagem secundária em temperatura ambiente por até ½ h antes da geração do sinal.

Geração de sinal e detecção (procedimento de uma membrana)

1. Dois pedaços de fita SaranWrap flat para o tampo da mesa (uma para o passo 2 e um para a etapa 4).
2. Cuidadosamente drenar o tampão em excesso da membrana, tocando os cantos da membrana contra a lateral do recipiente e transferência da membrana para o SaranWrap (lado da amostra para cima).
3. Despeje 07/06 ml de reagente ECF sobre a membrana e enrole vezes Saran mais de membrana. Cuidadosamente distribuir ECF reagente sobre a membrana suavemente movendo um Kimwipe sobre o SaranWrap. Incubar por 5 min.
4. Drenar o excesso de reagente ECF da membrana e transferi-lo para novas SaranWrap, embrulhe vezes ao longo da membrana, e selar as bordas com fita adesiva. Cobrir a membrana com papel alumínio. Incubar por 1-2 horas.
5. Prepare o vidro do scanner através da distribuição de 1-2 ml de reagente ECF sobre a placa de vidro. Em seguida, transferir a membrana para a placa de vidro (lado da amostra para baixo) e distribuir outra ml de reagente ECF 02/01 sobre a membrana. Sobreposição com SaranWrap e empurre cuidadosamente todas as bolhas de ar longe da membrana. (Você pode colocar uma placa rígida em cima da membrana SaranWrap manter pressionada contra a placa de vidro.)
6. Use o Fuji FLA-5100 scanner de fluorescência ("1 laser 1 imagem" mode) com as seguintes configurações: excitação 473 nm, a detecção de filtro LPB (510 nm), resolução de 50 mm, graduação sinal de 16 bits, CH1 400 V. (Scan leva cerca de 15-20 minutos por membrana de tamanho 22 por 22 cm.)
   
   Opcional:
   
   
7. Deixe descansar por 2-4 horas (ou mais).
8. Repita scan como no passo 6.

3. Stripping e armazenamento de procedimento (NUF versão)

1. Transferência de membrana para 100% ethanol e incubar em temperatura ambiente por 10 min com agitação suave.
2. Substituir com etanol 100% frescos e incubar overnight em temperatura ambiente. (Membrane pode permanecer em etanol por vários dias.)
3. Substituir de etanol com água destilada e incubar em temperatura ambiente por 10 min.
4. Adicione 100 ml de água e 5 ml de 10% SDS (final SDS 0,5%) a um tubo de hibridização e misture delicadamente. Adicionar membrana.
5. Incubar a 80 ° C por 1 h.
6. Transferência de membrana para um recipiente limpo e vazio.
7. Adicione 500 ml de água e 5 ml de SDS 10% (final SDS 0,1%) e um copo de calor a uma fervura vigorosa no forno de microondas.
8. Despeje o próximo ponto de ebulição 0,1% SDS solução sobre a membrana e agite suavemente por alguns minutos. Deixe esfriar até a temperatura ambiente.
9. Enxágüe em pelo menos 250 ml de estéril 100 mM Tris pH 8 por pelo menos 10 min.
10. Enrole membrana em SaranWrap e bordas cuidadosamente estreita com fitas. Armazenar a 4 ° C. (Membranas nunca deve secar.)

Discussion

O procedimento de stripping não foi otimizado. No entanto, o procedimento de stripping dada na instrução do fabricante (2 lavagens cada uma, 10 min em etanol 100%, uma lavagem de 1 hora a 60 ° C em 0,5% SDS) é insuficiente. Pelo menos de incubação durante a noite em etanol a 100% é necessário para dissolver o produto da reação ECF; de incubação de vários dias em etanol 100% parece não ter efeitos adversos sobre a capacidade de reprobe da membrana. Tratamento do fabricante SDS também parece ser insuficiente. NUF tentou 1 hora a 80 ° C com 0,5% SDS seguido por um tratamento com quase fervendo SDS 0,1% com sucesso. Tracy mostrou que um tempo derramando-over com quase fervendo SDS 0,1% é suficiente.

Dicas úteis:
O tampão de hibridação, tubo de hibridização e tampão de lavagem primária deve ser pré-aquecido a 60 ° C antes do uso, e deve ser mantido a essa temperatura durante todo o experimento. Por exemplo, manter o buffers em uma placa de aquecimento com um termômetro imerso; em uma placa de aquecimento Corning, uma configuração de cerca de 3 resultados em 60 ° C.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
AlkPhos Direct Labelling Reagents	kit	Amersham	RPN3680	Contains labeling reagent, cross-linker solution, reaction buffer, water, control DNA, hybridization buffer, blocking reagent. Store hybridization buffer and blocking reagent at room temperature, other reagents at 2-8°C.
ECF Substrate	kit	Amersham	RPN3685	Contains ECF substrate, ECF substrate dilution buffer.Note: Pack contains total 60 ml reagent; aliquot into 10 ml samples in Falcon tube and store at 20°C. Use about 10 ml per membrane (size of 22 by 22 cm).
20x Secondary Wash Buffer	buffer			121 g Tris(final 1 M), 117 g NaCl(final 2 M).Adjust pH to 10. Adjust to 1 L with water. Store at 2-8°C for up to 4 months.
0.5 M NaH2PO4 buffer pH 7	buffer			69 g NaH2PO4.H2O. Adjust pH to 7 with NaOH. Adjust to 1 L with water. Store at room temperature.
1 M MgCl2				50.8 g MgCl2.6H2OAdjust to 250 ml with water. Store at room temperature.
10% (w/v) SDS				20 g SDSAdjust to 200 ml with water. Store at room temperatur
Combination pack RPN3692 = RPN3680 + RPN3685