Metagenomic Kütüphaneler Büyük Ölçekli Ekranlar

Summary

Abstract

Metagenomic kütüphanelerde arşiv önce ekimi gerektirmeden mikroorganizmalardan bitişik genomik dizilerinin büyük parçaları. Metagenomic kütüphaneler oluşturulması ve tarama için akıcı bir prosedür oluşturma kültürsüz mikrobiyal topluluklarının genetik ve metabolik özelliklerini içine verimli, yüksek verimli araştırmalar için yararlıdır. Burada, anahtar protokolleri, dönüşümlü olarak robotik enstrümantasyon ve (insan) manuel müdahaleler bağlıdır uzun bir süreç doğru bir şekilde tanımlamak için en yararlı biçimde. Öneriyoruz video sunulmaktadır. Birincisi, biz, yirmi dört 384-iyi kütüphane plakalar yinelenen koloniler içerebilir, her biri yüksek yoğunluklu macroarray membranlar üzerine kütüphane klonlar, nokta robotik istihdam. Otomasyon da çok yoğun mekansal düzenlemeler, çok sayıda kütüphane klonların sığdırmak için gerekli ölçek minyatürleştirme nedeniyle hassasiyet ve hız için sadece bu işlem için gerekli, ancak. Bir kere üretilen, önümüzdeki macroarray membranlar prob etiketleme, membran hibridizasyon ve sinyal tespiti için standart protokoller değiştirilmiş sürümlerini kullanarak ilgi genlerin nasıl gösterildi gösterdi. Biz online video yanında tüm bunların ayrıntılı bir yazılı ilgili adımları açıklamaları ve gerekli malzemeler, görsel bir gösteri ile bu işlemler tamamlanmaktadır.

Protocol

1. Hibridizasyon prosedürü

Bir hibridizasyon tüp 1 veya 2 membranlar (22 cm boyutu 22) alacak. Hibridizasyon karışımı 50 ml ve 0.5 mg DNA prob hibridizasyon tüp başına (10 ng / ml son konsantrasyon) kullanın. En iyi sonuç için, jel-saflaştırılmış DNA prob olarak kullanın. Prob hazırlanması ölçeklendirme, tüpler numarası yerine tüp başına reaktiflerin miktarını artırarak artar.

Probe hazırlık (0.5 mg DNA):

1. Su 60 ul ile 15 ul çapraz bağlayıcı çözüm sulandırınız.
2. DNA 10 ng / vidalı kapaklı bir mikrotüp 50 ul toplam hacmi su ile ul seyreltilir.
3. Kaynar suda 5 dakika denatüre DNA.
4. Hızla buz transferi ve 5 dakika soğumasını bekleyin. Kısaca Spin.
5. 50 ul reaksiyon tamponu ekleyin ve hafifçe karıştırın.
6. 10 ul etiketleme reaktif ekleyin ve hafifçe karıştırın.
7. 50 adım 1 seyreltilmiş çapraz bağlayıcı bir çözüm ul ekleyin ve hafifçe karıştırın. Yavaşça vorteksleyin ve kısaca döndürün.
8. 37 ° C'de 30 dakika inkübe edin.
9. 2 saat kadar buz tutunuz veya -20 ° C'de% 100 gliserol ve mağaza eşit hacimde
   
   Not: kit ile birlikte su kullanın. Aksi belirtilmedikçe bütün reaktifler buz üzerinde tutun.

Membran hazırlama ve hibridizasyon

1. Hibridizasyon tamponu ve hibridizasyon tüp Onceden 60 ila 50 ml ° C
2. Hibridizasyon tüp hibridizasyon tamponu ekleyin. Membran (ler) Rulo ve hibridizasyon tüp ekleyin. (Tüp başına 2 membranlar, tamamen bir membran kadar ilk rulo eklenirse, o zaman aynı yönde diğer membran üst döndürün.)
3. Inkübe hibridizasyon tüp, 60 ° C, en az yarım saat (Membran (ler) iyice ıslatılmış aldığınızdan emin olun.)
4. Hibridizasyon tüp tüp etiketli prob içeren uzun bir pipet ile hibridizasyon tamponu yaklaşık 1 ml aktarın. Yavaşça vorteksleyin ve kısaca döndürün. Hibridizasyon tüpe geri karışımı aktarın.
5. 60 ° C gece inkübe edin.
   
   Not: Kullanım forseps ve eldiven membranlar işleme. Hibridizasyon tüplerin Mix içerik nazikçe, çünkü çok fazla ajitasyon istenmeyen köpük kalıcı oluşumuna sebep olacaktır. Membranlar ıslak durumda eklenmelidir; hibridizasyon gerekirse tampon ya da su ile ıslatın ve aşırı sıvı eklemeden önce boşaltın.

2. Algılama prosedürü

Yıkama membranlar

1. 60 ° C'ye ısıtın birincil yıkama tamponu (Mikrodalga fırın ve / veya ısıtma plakası kullanın.)
2. Bir melezleşme tüp 2 membranlar varsa, bir membran temiz, önceden ısıtılmış, boş hibridizasyon tüp transferi.
3. Kısaca temel yıkama tamponu yaklaşık 50 ml hibridizasyon tüp durulayın.
4. 60 hibridizasyon tüp ve inkübe ° C de 10 dakika süreyle birincil yıkama tamponu yaklaşık 100 ml ekleyin.
5. 3. ve 4. adımı yineleyin.
6. 5 dakika boyunca oda sıcaklığında en az 250 ml orta yıkama tamponu ile konteyner ve inkübe yıkama membran aktarın.
7. 6. adımı tekrarlayın.
   
   Not: Membranlar sinyal nesil önce yarım saat kadar, oda sıcaklığında ikincil yıkama tamponu muhafaza edilebilir .

Sinyal üretimi ve algılama (bir membran prosedürü)

1. Masaüstü üzerine SaranWrap düz Bant iki adet (2 için bir adım ve bir adım 4).
2. Kabın kenarına membran köşelerine dokunarak membran aşırı tampon dikkatlice boşaltın ve SaranWrap üzerine (kadar örnek tarafı) membran transfer.
3. Membran ve membran üzerinde kat Saran wrap üzerinde ECF reaktif 6-7 ml dökün. Membran üzerinde dikkatlice SaranWrap üzerinde Kimwipe hafifçe hareket ettirerek ECF reaktif dağıtın. 5 dakika boyunca inkübe edin.
4. Membran fazla ECF reaktif boşaltın ve üzerine yeni SaranWrap, membran üzerinde kat sarın, transferi ve bant ile kenarları mühür. Membran alüminyum folyo ile örtün. 1-2 saat inkübe edin.
5. ECF reaktif 1-2 ml cam plaka üzerinde dağıtarak tarayıcı cam plaka hazırlayın. Daha sonra cam plaka üzerine membran (aşağı örnek tarafı) transferi ve ECF reaktif membran üzerinde başka bir 1-2 ml dağıtmak. SaranWrap Yerleşimi ve membran uzak dikkatle tüm hava kabarcıkları itin. (SaranWrap üstüne bir cam levha karşı bastırdı zar tutmak için sert plaka koyabilir.)
6. Uyarma 473 nm, algılama filtresi LPB (510 nm), çözünürlük 50 mikron, 16-bit sinyal mezuniyet, CH1 400 V. (Tarama: Aşağıdaki ayarları ile Fuji FLA-5100 floresan tarayıcı ("1 lazer 1 resim" modu) kullanın. 22 cm boyutu 22 membran başına yaklaşık 15-20 dakika sürer.)
   
   İsteğe bağlı:
   
   
7. 2-4 saat (veya daha uzun) bekletin.
8. 6. adımı olduğu gibi tarama işlemi tekrarlayın.

3. (Nufkullanıcısının versiyon) Dekapaj ve prosedür depolama

1. % 100 ve membran aktarınyavaşça sallanarak 10 dakika oda sıcaklığında hanol ve kuluçkaya yatmaktadır.
2. Taze% 100 etanol ile değiştirin ve oda sıcaklığında bir gece inkübe. (Membran birkaç gün etanol içinde kalır.)
3. Distile su ile etanol değiştirin ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.
4. SDS (son% 0.5 SDS) bir melezleşme tüp, 100 ml su ve 5 ml% 10 ekleyin ve hafifçe karıştırın. Membran ekleyin.
5. 80 ° C 1 saat inkübe
6. Temiz, boş konteyner membran aktarın.
7. % 10 SDS 500 ml su ve 5 ml (final% 0.1 SDS) güçlü bir mikrodalga fırın kaynatmak için bir beher ve ısı ekleyin.
8. Yakın kaynar% 0.1 SDS çözümü membran üzerine dökün ve hafifçe birkaç dakika için ajitasyon. Oda sıcaklığına kadar soğumasını bekleyin.
9. En az 10 dakika süreyle en az 250 ml steril 100 mM Tris, pH 8 durulayın.
10. Wrap SaranWrap membran ve bant ile dikkatlice yakın kenarları. 4 ° C saklayınız (Membranlar kurumasına asla gerekir.)

Discussion

Soyma işlemi optimize edilmemiştir. Ancak, üreticinin talimatı (2 yıkar, her biri 10 dakika, 1 saat 60 ° C 'de% 0.5 SDS% 100 etanol içinde 1 yıkama) verilen soyma işlemi yetersizdir. Gecede en az% 100 etanol inkübasyon ECF reaksiyon ürünü çözmek için gereklidir;% 100 etanol birkaç gün kuluçka membran reprobe yeteneği üzerinde hiçbir olumsuz etkisi var gibi görünüyor. Ayrıca üretici SDS tedavi yetersiz görünüyor. Nufkullanıcısının 80 1 saat çalıştı ° C,% 0.5 'SDS bir tedavi ile başarı ile yakın kaynar% 0.1 SDS izledi. Tracy yakın kaynar% 0.1 SDS üzerinden dökülen bir kez yeterli olduğunu göstermiştir.

Yararlı ipuçları:
Hibridizasyon tamponu, hibridizasyon tüp ve birincil yıkama tamponu 60 Önceden ısıtılmış olmalıdır ° C önceden kullanmak ve deney boyunca bu sıcaklıkta tutulmalıdır. Örneğin, dalmış bir termometre ile ısıtma plakası tamponlar tutmak; Corning ısıtma plakası, 60 ile ilgili 3 sonuç bir ayar ° C

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
AlkPhos Direct Labelling Reagents	kit	Amersham	RPN3680	Contains labeling reagent, cross-linker solution, reaction buffer, water, control DNA, hybridization buffer, blocking reagent. Store hybridization buffer and blocking reagent at room temperature, other reagents at 2-8°C.
ECF Substrate	kit	Amersham	RPN3685	Contains ECF substrate, ECF substrate dilution buffer.Note: Pack contains total 60 ml reagent; aliquot into 10 ml samples in Falcon tube and store at 20°C. Use about 10 ml per membrane (size of 22 by 22 cm).
20x Secondary Wash Buffer	buffer			121 g Tris(final 1 M), 117 g NaCl(final 2 M).Adjust pH to 10. Adjust to 1 L with water. Store at 2-8°C for up to 4 months.
0.5 M NaH2PO4 buffer pH 7	buffer			69 g NaH2PO4.H2O. Adjust pH to 7 with NaOH. Adjust to 1 L with water. Store at room temperature.
1 M MgCl2				50.8 g MgCl2.6H2OAdjust to 250 ml with water. Store at room temperature.
10% (w/v) SDS				20 g SDSAdjust to 200 ml with water. Store at room temperatur
Combination pack RPN3692 = RPN3680 + RPN3685