הפקה של טראנסגנטי Xenopus laevis על ידי שילוב אנזימים מתווכת הגבלת והשתלות גרעיני

Summary

זה פרוטוקול וידאו מדגים שיטה להפקת מהונדס

Abstract

שילוב יציב של מוצרים גן משובט לתוך הגנום Xenopus יש צורך לשלוט על הזמן והמקום של ביטוי, להביע את הגנים בשלבים מאוחרים יותר של ההתפתחות העוברית, וכדי להגדיר כיצד משפרי ומקדמי לווסת התבטאות גנים בתוך העובר. פרוטוקול הפגינו כאן ניתן להשתמש כדי לייצר ביעילות מהונדס Xenopus laevis עוברים. גישה זו transgenesis כוללת שלושה חלקים: 1. גרעינים זרע מבודדים מבוגר X. laevis testis על ידי טיפול lysolecithin, אשר permeabilizes הממברנה הפלסמטית הזרע. 2. ביצה היא תמצית שהוכנה על ידי צנטריפוגה במהירות נמוכה, תוספת של סידן לגרום לחלץ להתקדם שלבי הביניים של מחזור התא, וכן צנטריפוגה במהירות גבוהה לבודד cytosol שלבי הביניים. 3. השתלת גרעיני: גרעין ותמצית בשילוב עם ה-DNA פלסמיד לינארית להיות הציג כמו transgene ואת כמות קטנה של אנזים הגבלה. במהלך התגובה קצר, לחלץ ביצה חלקית decondenses הכרומטין זרע האנזים הגבלה יוצרת הפסקות כרומוזומליות המקדמים של transgene רקומבינציה לתוך הגנום. גרעינים זרע שטופלו מושתלים מכן לתוך ביצים מופרית. שילוב של transgene מתרחשת בדרך כלל לפני המחשוף העוברית הראשונה כגון כי עוברי וכתוצאה מכך הם לא chimeric. עוברים אלו ניתן לנתח ללא כל צורך לגדל את הדור הבא, המאפשר לדור יעיל ומהיר של עוברים מהונדס עבור ניתוחים של האמרגן ותפקוד הגן. למבוגרים X. laevis הנובע הליך זה גם להפיץ את דרך transgene germline והוא יכול לשמש כדי ליצור שורות של חיות טרנסגניות למטרות מרובות.

Protocol

גרסאות של גישה זו transgenesis תוארו לראשונה בשנת ¹ ו ^-2.

גרעינים א זרע הכנה

שיטה זו הכנה גרעינים מותאמת מוריי ^3, אבל מעכבי פרוטאז הושמטו כפי שהם להפריע להתפתחות הבאות של ביצים המושתלים עם גרעיני זרע. Aliquots קפואים ב -80 מעלות וניתן להשתמש בו עבור השתלות במשך כ 6 חודשים.

כל הפתרונות צריכים להיות מוכנים והניח על הקרח לפני תחילת ההכנה.

1. הרדימי 1-2 מבוגר זכר X. laevis על ידי טבילה Tricaine דקות לפחות 20 ואחריו pithing; להסיר את האשכים.
2. מגלגלים את האשכים על מגבת נייר כדי להסיר את הדם, כלי הדם השומן בגוף, לשטוף אותם בקצרה בצלחת פטרי 60 מ"מ המכיל 1XMMR, ולהסיר כל החלקים הנוספים של השומן בגוף. הקפד לא לנקב את האשכים, כמו זה משחרר את הזרע.
3. העברת האשכים אל צלחת פטרי יבש 60 מ"מ האשכים מרוכך עם מלקחיים עד שאין גושים נראים לעין. מסמוס צריך להיעשות כמו ביסודיות ככל האפשר כדי להשיג תשואות גבוהות של גרעינים.
4. הוסף חוצץ 2mLs קר הכנה גרעיני (NPB: 1X ממלאי) את מרוכך פיפטה בעדינות מעלה ומטה.
5. מרוכך Squirt על דרך 4 שכבות של אריג על משפך, איסוף לשפופרת 15 מ"ל (למשל Falcon 2059); לשטוף צלחת עם 8mLs של NPB ולשים זה לשטוף באמצעות גזה, איסוף זה בצינור. בידיים עטויות כפפות לסחוט את גזה כדי לאסוף נוזלים הנותרים לתוך הצינור.
6. גלולה הזרע בסל"ד 3000 עבור 10 דקות. ב 4 מעלות צלזיוס הרוטור דלי מתנדנד (1480g למשל רוטור Sorvall HB-4 או שווה ערך) עם מתאמי הצינור המתאים. NPB להוסיף 8ml אל הצינור הזה פיפטה מעלה ומטה עם טפטפת מ"ל 10 עד resuspend גלולה;; למזוג supernatant ספין למטה שוב supernatant מעל למזוג. לאזן 1mL של NPB לטמפרטורת החדר במהלך הסיבוב.
7. Resuspend גלולה ב NPB 1mL טמפרטורת החדר באמצעות 1 מ"ל pipetteman טיפ, להוסיף 50μl של lysolecithin 10mg/mL טריים, מערבבים בעדינות, דגירה של 5 דקות. בטמפרטורת החדר.
8. הוסף 10 מ"ל BSA קר 1XNPB 3% ל הצינור כדי לעצור את התגובה lysolecithin, מערבבים בעדינות, ספין למטה 10 דקות ב 3000 סל"ד ב הרוטור דלי מתנדנד. למזוג supernatant. Lysolecithin שטופלו גלולה צריך להיראות קצת יותר שקוף (לבן אטום פחות) מאשר לפני הטיפול lysolecithin.
9. למזוג supernatant ו resuspend גלולה ב 5 מ"ל קר NPB BSA 0.3%, לערבב בעדינות עם טפטפת 10 מ"ל ו - ספין למטה 10 דקות ב 3000rpm לעיל.
10. למזוג supernatant ו resuspend גלולה ב 500μl של חיץ זרע אחסון והעברת צינור 1.5 מ"ל. זהו עכשיו במלאי הגרעינים שלך. חנות על הקרח בזמן לבדוק את התשואה של גרעינים.
11. כדי לבדוק את התשואה של גרעינים, מקום 98 μl של חיץ זרע דילול (sdb), 1 μl של המניה גרעיני 1μl של דילול 1:100 של המניה Hoechst בצינור Eppendorf 1.5mL. מערבבים את מלאי גרעיני היטב באמצעות כתער מקוטע (או גדול הפתיחה) טיפ פיפטה רק לפני הסרת μl 1. מערבבים את sdb בדילול מלא / Hoechst / גרעינים היטב לאפשר כמות קטנה לזרום לתוך החדר של hemacytometer Neubauer משופרת על ידי פעולה נימי. ספירת גרעינים בכיכר של hemacytometer מתחת למיקרוסקופ המתחם. מ זכר אחד, אתה צריך להשיג סעיפים של לפחות 100-200 (X10 ⁴ תאים / מ"ל) עבור דילול זה 1:100 של המניה ריכוז המניה חי של 1-2x10 ⁵ תאים / μl. אם המניה שלך מרוכז פחות, בואו הגרעינים להתיישב במשך כמה שעות, להסיר חלק supernatant, ולספר. השאירו את הגרעינים ב 4 ° C למשך הלילה כדי לאפשר גליצרול לחדור עבור cryopreservation טוב יותר, ואז לערבב את מלאי גרעיני היטב עם טיפ גדול פתח פיפטה, להכין aliquots 20μl, ומקפיאים בחנקן נוזלי.

ב הכנת תמצית מהירות גבוהה

שיטה זו מותאמת מוריי ³ ומייצרת תמצית cytosolic שלבי הביניים אשר תקדם decondensation הכרומטין נפיחות חלקית של גרעיני זרע הוסיף. תמצית ניתן קפוא aliquots קטן -80 ° C ו להפשיר לפני השימוש.

1. 3-5 ימים לפני הזריקה HCG, הממשלה 8-12 מבוגר הנשי X. laevis על ידי הזרקת 50 U של PMSG לתוך שק הלימפה הגבי. בערב שלפני הכנת תמצית, להזריק כל צפרדע עם 500 יחידות HCG ומקום 2 צפרדעים / מיכל לתוך 1XMMR ליטר 2. מאז צפרדע אחת עם lysing או הפעלת ביצים יכולים להתפשר על הכנת תמצית, רצוי להפריד צפרדעים לתוך זוגות לקראת הביוץ.
2. למחרת בבוקר, להכין צמרמורת כל הפתרונות לפני תחילת ההכנה. בעדינות ידנית לגרש ביצים כל צפרדע לתוך b גדולeakers המכיל 1X MMR. מסך ביצים ממיכל כל להשמיט כל קבוצות של ביצים עם סימני lysing נימרו, או הפעלה (דמיינו על ידי התכווצות של פיגמנטציה בחצי הכדור החי) מן הנוהל. איסוף ביצים רצוף עם פיגמנטציה אפילו. ביצים טוב ניתן גם שנאספו MMR 1X ב דליים צפרדע. ההיקף הכולל של ביצים צריך להיות> 100 8-12 מ"ל מן הנקבות.
3. De-ג'לי את הביצים. כדי לעשות זאת, להסיר MMR ככל האפשר, להוסיף כמות קטנה של פתרון ציסטאין, ומערבלים את הביצים. החלף עם פתרון ציסטאין טרי מספר פעמים במהלך דה קרישה. De-ג'לי כל אצווה של ביצים בנפרד ולמחוק קבוצות עם שבירה או הפעלת ביצה. מערבבים את שאר הביצים.
4. לשטוף את הביצים ארבע פעמים ~ 35 מ"ל של תמצית חיץ (XB) ולאחר מכן פעמיים בתוך 25 מ"ל של CSF-XB עם מעכבי פרוטאז.
5. כדי לארוז את הביצים: להעביר את הביצים לתוך צינורות Beckman ultraclear. אפשר ליישב את הביצים. הסר כמה CSF-XB האפשרי. צנטריפוגה את הביצים באמצעות SW Beckman 40 Ti הרוטור (רוטור או דומה) ב 1000 סל"ד (150 גרם) של ~ 60 שניות ב 4 ° C. הסר פתרון עודף מהחלק העליון של הביצים ארז.
6. כדי לרסק את הביצים ליצור cytoplasmic לחלץ: צנטריפוגה את הביצים על 10,000 סל"ד (16,000 ז) עבור 10 דקות ב 4 ° C. הביצים צריך להפריד לשלוש שכבות: שומנים בדם (למעלה), הציטופלסמה (במרכז) וחלמון (התחתון). איסוף שכבת cytoplasmic מהצינור כל אחד עם מחט 18-מד ידי החדרת מחט דרך הצינור בבסיס שכבת cytoplasmic. מעבירים את הציטופלסמה אל צינור טרי Beckman ultraclear על הקרח.
7. הוסף מעכבי הפרוטאז כדי הציטופלסמה מבודד לריכוז סופי של 1X. Recentrifuge הציטופלסמה ב g 16,000 עבור 10 דקות ב 4 ° C. אסוף את הציטופלסמה הבהיר כמתואר לעיל. מצפה לקבל 0.75-1 הציטופלסמה mL / צפרדע.
8. מוסיפים 1 / 20 מהנפח תמצית של תמהיל האנרגיה המדגם. העברה לתוך הציטופלסמה עבה חומה צינורות פוליקרבונט עבור ultracentrifuge TL-100 Beckman. צינורות להחזיק כ 3 מ"ל כל אחד צריך להיות לפחות חצי מלא.
9. הוסף 1 M CaCl ₂ אל צינור כל לריכוז סופי של 0.4 מ"מ. דגירה צינורות במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. זה inactivates CSF ודוחף את תמצית לתוך שלבי הביניים.
10. מאזן צינורות צנטריפוגה אותם ultracentrifuge TL-100 Beckman באמצעות הרוטור 100.3-TLA ב 70,000 סל"ד (200,000 גרם) במשך 1.5 שעות ב 4 ° C. הציטופלסמה יהיה fractionate לארבע שכבות, מלמעלה למטה:, שומנים cytosol, קרום / המיטוכונדריה, ואת גליקוגן / ריבוזומים.
11. הסירו את השכבה cytosolic מהצינור כל (~ 1 מ"ל אם 2-3 מ"ל נטען לתוך הצינור) על ידי החדרת המזרק לתוך החלק העליון של הצינור דרך שכבת השומנים. העברת חלק cytosolic לצינורות טריים recentrifuge דגימות ב 70,000 סל"ד (200,000 גרם) במשך 20 דקות ב 4 ° C.
12. Aliquot supernatant תוך 25-μl aliquots ב 0.5-מ"ל צינורות. מהיר להקפיא את aliquots בחנקן נוזלי חנות ב -80 ° C עד השימוש. כדי לקבוע אם לחלץ את יעיל, גרעינים זרע יכול להיות מודגרות בתמצית ומוכתמים Hoechst כדי לקבוע אם הגרעינים בעליל להתנפח (לעבות ולהאריך) בתוך 10 דקות של תוספת בטמפרטורת החדר.

ג התגובה Transgenesis והעברת גרעיני

חשוב: בדוק פתרונות, ציוד צפרדעים יהיו מוכנים לגמרי לפני תחילת התגובה. ברגע שתתחיל, אתה חייב להמשיך עם התגובה באמצעות לוח זמנים משוער המתוארים להלן, שכן מרכיבים רבים אינם נשארים יציבים> 30 דקות. בעוד מניות גרעין הזרע נשמר על הקרח, תגובות transgenesis (הן בדילול ומרוכז) יש לשמור בטמפרטורת החדר.

1. צפרדעים נקבה הממשלה. ערב לפני transgenesis, להזריק מספר (3-5) נשים צפרדע מבוגר עם 800 יחידות HCG בשק הלימפה הגב להשיג טרי ביצים בתחילת למחרת.
2. יום של ההליך transgenesis, להכין או להביא לטמפרטורה הפתרונות הדרושים transgenesis:
   1. ציסטאין טריים (2.5% ב 1XMMR, pH8.0). יהיה עליך כמה מאות מיליליטר לשמש באותו יום.
   2. 0.2XMMR Ficoll 6% עבור מנות השתלה ושחזור של עוברים מהונדס ו 0.2XMMR 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​גנטמיצין (ללא Ficoll) לגיוס עוברים. פתרונות לא צריך להיות חם יותר מאשר 18-21 מעלות צלזיוס ועוברים מהונדס יש להעלות דרך השסעים מוקדם בטמפרטורות שבין 16 ו - 21 ° C, שכן בטמפרטורות גבוהות הן להשפיע לרעה על תדירות transgenesis ואת ההתפתחות העוברית.
   3. להפשיר לאזן את הטמפרטורה בחדר aliquots קפוא של sdb (דילול מאגר זרע) עבור השתלות של היום, להפשיר את תמצית מהירות במקום גבוה על הקרח, ולהכין 100mm MgCl ₂ פתרון.
   4. צא הדואר agarose מנות הזרקה ולמלא עם פתרון ה-MMR / Ficoll, ולהקים מראש להפעיל את משאבת עירוי כדי לייצב את הזרימה.
   5. בדוק כי צפרדעים הנקבה להטיל ביצים הם באיכות גבוהה. באופן אופטימלי, צריך ביצים קליפה המשרד (להחזיק צורה אחרי דה קרישה).
3. הגדרת התגובה transgenesis:
   1. מאוד בעדינות (בעזרת פיפטה טיפ מקוטע) לערבב את מניות גרעין ולשלב בתוך שפופרת 1.5mL Eppendorf:
      גרעינים 4μl (~ 4-8x10 ⁵ גרעינים)
      2μl לינארית פלסמיד (100ng/μl)
      דגירה 5 דקות בטמפרטורת החדר.
   2. זמן הדגירה הוא הליך, לדלל 0.5μl של אנזים הגבלה ב 4.5μl H ₂ O ולהוסיף 1μl של אנזים מדולל כדי 18μl של sdb, 2μl של MgCl ₂ ו 2μl של תמצית במהירות גבוהה. מוסיפים את התערובת לתגובה גרעינים, פלסמיד. דגירה 10 דקות יותר להתנפח את הגרעינים.
   3. במהלך הדגירה זה, לסחוט ביצים 2-3 צפרדעים דה ג'לי בפתרון ציסטאין. לשטוף אותם היטב (5X) עם 1XMMR, ולהשתמש פיפטה נשא רחב להעביר ביצים dejellied 400-500 על כל מנה agarose היטב המכיל 0.2X Ficoll MMR 4%. בדרך כלל זה לוקח בערך 10 דקות, אז פעם אחת המנות ביצה מוכנים התגובה היא בדרך כלל מוכן לדלל.
   4. כ 15-20 דקות לאחר תחילת שלב, לערבב בעדינות את התגובה (גרעינים / לחלץ / DNA) עם טיפ מקוטע ולהוסיף על 5μl עד 150 sdb μl בטמפרטורת החדר. גרעינים בתערובת זו בדילול יציבים כ 1 שעות., בעוד שהם לא שומרים על כושר השתלת עוד כאשר נותרו תערובת מרוכזת.
4. טען את מחט: מערבבים את התגובה בדילול מוכן מעל בעדינות עם קצה פתח רחב פיפטה, ולאחר מכן לטעון את המחט מיד, כמו גרעינים יישב במהירות בצינור. כדי המחט backload, במקום חתיכת צינור Tygon קנס על סיום קצה מקוטע פיפטה 200μl. צייר את הפתרון אל קצה פיפטה, ואז לצרף את צינורות אל המחט ויאפשר פתרון כדי להזין את המחט על ידי כוח הכבידה או מדכא בעדינות על הבוכנה פיפטה.
5. צרף מחט לשאוב צינורות ולהתחיל השתלות של גרעינים. זריקות צריך להיות מהיר, רדוד כ בניצב הממברנה הפלסמטית של הביצית, כדי למנוע נזק. בקצב של זרימת הציע (10nl/sec), לשמור את המחט הביצה עבור ~ 0.5 שניות. אתה צריך להשלים 1-2 מנות של השתלות בתוך 20-30 דקות.

לאחר זריקות, להשאיר את הכלים ב 16-20 מעלות צלזיוס עד העוברים הגיעו לשלב 4-8 תאים. מיין עוברים ביקוע מן השכנים הלא השחיטה שלהם על ידי העברת (עם פיפטה פסטר זכוכית עם טיפ בערך בקוטר זהה ביצה) כדי בקערה גדולה טרי Ficoll 0.2XMMR 4%. לחלק את העוברים ביקוע לקבוצות קטנות (10-15 עוברים / גם צלחת 6-באר) ותרבות 0.2XMMR (אין Ficoll) 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​גנטמיצין דרך בהתפתחות המוקדמת. לעוברים יש לבדוק במהלך gastrulation עם כל העוברים למות להסיר לאלתר את התקשורת השתנתה לפי הצורך.

פתרון בעיות:

1. מחט חסומה: זרימה פתרון מן המחט צריכה להיות ברורה במהלך השתלות. אם המחט נחסם על ידי חומר חלקיקי לעין, לשנות מחטים או לנסות להסיר את הלכלוך על ידי חיתוך קצה עם מלקחיים ודוחף פתרון דרך המחט.
2. אין ביצים ביקוע מתקבלים: לבדוק דילולים של גרעיני זרע ונפח ההזרקה מתאימים וכי מחט לא נחסמה במהלך ההשתלה. אם נפח הזרקה גבוה מדי, ביצים יכול גם לא לדבוק ובמקום להראות פיגמנטציה או נזק ודהוי.
3. עוברים רבים מתים במהלך gastrulation. מספר גורמים יכולים לשפר את ההישרדות העובר:
   1. לטפל עם גרעינים במהלך הכנת התגובה האנזימטית. גרעינים Decondensed שבירים ויש צורך המושתלים באמצעות לוח הזמנים לעיל. אין למקם אותם על הקרח.
   2. הנזק שנגרם כרומוזומליות גרעיני זרע במהלך התגובה אנזים והעברת גרעיני משפיע על תדירות transgenesis לבין התפתחות תקינה של עוברים. נזק כרומוזומלית אל הגרעינים משפר את היעילות של transgenesis אבל משפיעה לרעה על ההישרדות / התפתחות תקינה. הקטנת או השמטת אנזים הגבלה במהלך הדגירה את האנזים יכולים לשפר את קצב התפתחות תקינה, אך עשוי להקטין תדירות transgenesis או מספר עותק הפלסמיד מוחדר בגנום העובר.
   3. אם blastula מאוחר עוברים דרך gastrula להראות סימנים של שינוי צבע או מוות של תאים אפשר גם כי מגיב המשמש השתלות היה רעיל את הביצים. בנוסף, אם ביצהזה לא צריך קליפה המשרד, הם עשויים לעבור exogastrulation ולא מצליחים ליצור נורמלי שלאחר gastrula עוברים.
4. מספר עוברי המבטא את transgene נמוכה. להגדיל את כמות אנזים הגבלה.

נציג העובר תוצאות טראנסגנטי

עוברים טראנסגנטי כתוצאה מהעברות גרעיני יש להעלות עד ביטוי מן האמרגן של עניין נראה לעין. באיור 1 לעיל, מקדם אקטין בשריר כוננים הביטוי של חלבון פלואורסצנטי ירוק את somites של הראשן זה מהונדס.

Discussion

עבור כל אחד לבנות מהונדס להיבדק, אנחנו בדרך כלל השתלת גרעינים לתוך 500-1000 ביצים, בקנה המידה הזה, אנחנו יכולים ליצור עוברים מהונדס המבטא עד 10 מבנים שונים ליום, תלוי כמה נקבות רבות המושרה להטיל ביצים. של השתלות אלו, כשליש לדבוק ביצים 60-80% מהם עוברים דרך gastrulation ביקוע להמשיך כרגיל. בהתאם לתנאי התגובה המשמש, בין 10-50% של עוברים אלה מבטאים את transgene של עניין. לכן, לאחר הליך זה היא הוקמה בשנת במעבדה, זה אפשרי עבור עובד אחד כדי ליצור אוכלוסיות של עוברים מהונדס המבטא מספר פלסמידים שונים ביום אחד. Transgenes להשתלב בגנום כמו concatemer (5-35 עותקים), ולכן שיטה זו יכולה לשמש גם כדי cointegrate יותר transgene שונים לתוך הגנום של עובר יחיד בתדר גבוה (80-90%) ^4.

הגישה המתוארת כאן transgenesis בהצלחה שימשו misexpress הגנים של עניין, ללמוד ויסות הגנים, וליצור עוברים המבטאים סמן / כתב ניאון תאים או מבנים בעלי עניין (לדוגמה, ^4-7). Transgenes להיות מופצות דרך germline ^8. לבסוף, למרות הנוהל הוא הוכיח לשימוש עם Xenopus laevis כאן, יש גם הותאמו לשימוש המינים דיפלואידי בנושא, Xenopus tropicalis ^9.

Materials

A.Sperm nuclei preparation

Reagents:

1X MMR (2mM CaCl2, 5mM HEPES, pH7.5, 2mM KCl, 1mM MgCl2, 100mM NaCl). 0.1% Tricaine Methanesulfonate (MS222, aminobenzoic acid ethyl ester, Sigma A-5040), 0.1% sodium bicarbonate. Dissolve in water. 2X Nuclear Preparation Butter (NPB). On the day of the sperm nuclei preparation, make up 30 ml of 2X NPB from aliquots of the stock solutions stored frozen: 500 mM sucrose (1.5 M stock), 30 mM HEPES (1M stock; titrate with KOH so that pH 7.7 is at 15 mM), 1 mM spermidine trihydrochloride (Sigma S-2501; 10 mM stock), 0.4 mM spermine tetrahydrochloride (Sigma S-1141; 10 mM stock), 2 mM dithiothreitol (Sigma D-0632; 100 mM stock), 2 mM EDTA (500 mM EDTA, pH 8.0). Use the 2XNPB to make a. 30ml 1X NPB, b. 10ml 1XNPB+3%BSA (fraction V, Sigma A-7906), c. 5ml 1XNPB+0.3%BSA. Lysolecithin: 100 μl of 10 mg/ml L-α-lyso-Lecithin, Egg Yolk (Calbiochem, 440154); dissolve at room temperature just before use. Store solid stock at 20 °C. Discard the stock powder if it becomes sticky. Bovine serum albumin (BSA): 10% (w/v) BSA (fraction V, Sigma A-7906) Make up 5 ml in water on the day of the sperm nuclei preparation. Sperm storage buffer (1ml) 1X NPB, 30% glycerol, 0.3% BSA. Sperm dilution buffer: 250 mM sucrose, 75 mM KCl, 0.5 mM spermidine trihydrochloride, 0.2 mM spermine tetrahydrochloride. Titrate to pH 7.3-7.5 and store 0.5-1 ml aliquots at 20 °C. H–chst No. 33342 (Sigma B-2261): 10 mg/ml stock in dH2O, store in a light tight vessel at 20 °C.

Equipment:

Swinging bucket rotor and centrifuge cheesecloth dissection tools (forceps and scissors) fluorescence microscope funnel gloves hemocytometer needles (26 gauge) paper towels petri dishes (60 mm) pipettes plastic (5 and 10 ml) Pipetman tips (1 ml and 200μl) Syringes (1 ml) tubes (14 ml; Falcon, 2059) tubes microcentrifuge (1.5 ml)

B. Preparation of High Speed Extract

Reagents:

1X Marc's Modified Ringer (MMR): 100 mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 5 mM HEPES, pH 7.5. Prepare a 10X stock, and adjust pH with NaOH to 7.5. 20X Extract buffer (XB) salt stock: 2 M KCl, 20 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, filter-sterilize and store at 4 °C. Extract buffer (XB; freshly prepared and stored on ice): 1X XB salts, 50 mM sucrose,10mM HEPES (1 M stock, titrated with KOH so that pH is 7.7 when diluted to 15 mM; filter-sterilize, and store in aliquots at 20 °C). Prepare about 100 ml. 2% (w/v) L-Cysteine hydrochloride 1-hydrate: Made up in 1X XB salts before use and titrated to pH 7.8 with NaOH. Prepare about 300 ml. CSF-XB: 1X XB salts, 1 mM MgCl2 (in addition to MgCl2 present in XB salts; final concentration 2 mM), 10 mM HEPES, pH 7.7, 50 mM sucrose, 5 mM EGTA, pH 7.7. Prepare 50 ml. Protease inhibitors: Mixture of leupeptin, chymostatin, and pepstatin, each dissolved to a final concentration of 10 mg/ml in dimethyl sulfoxide (DMSO). Store in small aliquots at 20 °C. 1 M CaCl2. Energy mix: 150 mM creatine phosphate, 20 mM ATP, 20 mM MgCl2. Pregnant Mare Serum Gonadotropin (PMSG): 100 U/ml PMSG (P.G.600®, Intervet, Inc., 021825). Dissolve in water and stored at 20 °C. Human Chorionic Gonadotropin (HCG): 1000 U/ml HCG (CHORULON®, Intervet, Inc., 057176 ). Dissolve in water and stored at 4 °C.

Equipment:

Xenopus laevis females Needles (18 and 26 gauge) Pasteur pipette wide bore Syringes (1 mL) Tubes, microcentrifuge (0.5 mL) Tubes, thick-wall polycarbonate (Beckman, 349622) Tubes, ultraclear (14 x 95 mm; Beckman, 344060) Ultracentrifuge and rotors (e.g., Beckman TL-100 with rotors SW 40 Ti and TLA-100.3) Beakers for egg collection Buckets or containers for holding female frogs (e.g., 4-L plastic beakers with mesh lids).

C. Nuclear transplantation.

Reagents:

2.5% agarose in 0.1XMMR (for making injection dishes) 2.5% Cysteine in 1XMMR, pH8.0, prepared on the day of use Ficoll 10 mg/ml gentamycin (1000X stock) high speed egg extract (see above) 100 MgCl2 10X MMR (see above) Restriction enzyme (e.g. NotI from New England Biolabs) Sperm dilution buffer (SDB; see above) and sperm nuclei (see above) Human Chorionic Gonadotropin (HCG) as above mineral oil (Sigma, M8410) Linearized plasmid to be introduced as the transgene: Prepare linearized plasmid at a concentration of about 100 ng/μl in sterile, nuclease-free water (we avoid Tris and EDTA-containing buffers, which are somewhat toxic to embryos). The restriction enzyme used to linearize the plasmid d–s not have to be the same as the one used in the nuclear transfer reaction. We usually use NotI for all reactions, regardless of what plasmid is linearized with. Some calibration of the enzyme dilution used in the reaction may be necessary, as too much enzyme can cause adverse effects on post-gastrula development. Plasmid can be purified in several different ways: we usually use the Qiagen Qiaquick PCR purification kit according to the manufacturers directions; purification of a single band from a gel is not necessary. If plasmid is purified using phenol/chloroform extractions and ethanol precipitation, be certain to remove all traces of organics and ethanol.

Equipment:

Agarose dishes for injection: In a 60 mm plastic petri dish, lay a small 35mmX35mm weigh boat on molten 2.5% agarose in water 0.1XMMR to create a depression with an agarose-coated bottom for filling with eggs. Once agarose has hardened, wrap in parafilm and store at 4 °C until use. Make 2-3 dishes in advance for each transgenic reaction you plan to do.

Infusion pump: We use a single syringe infusion pump from Harvard Apparatus, equipped with a 3 cc syringe/needle filled with mineral oil (Sigma M-8410). Blunt the syringe needle tip (to keep it from perforating the tubing) and attach the fine tygon tubing. Run the pump at ~10nl/sec; this assumes that the time the needle is in each egg will be no greater than 1 sec. Pump should be pre-run for several minutes prior to starting transgenesis for the day to assure that the plunger for the syringe is flush with the piston and that steady positive flow of oil out of the tubing is occurring.

Needles for nuclear transfers. Using a micropipette puller, generate needles with long, sloping tips. Clip these with a forcep under a dissecting microscope equipped with an ocular micrometer to obtain an ~80 micron opening with a beveled shape.

Other equipment: Xenopus laevis females, stereomicroscope, incubator, micromanipulator, microinjection needle puller (e.g. Model P-87, Sutter), syringe needles (26 gauge), glass microinjection needles, ocular micrometer for calibrated clipping of microinjection needle tips to 80μm diameter, petri dishes, weigh boats 35mm, Tygon tubing (ID=1/32 in., OD=3/32 in.)