De productie van transgene Xenopus laevis Door restrictie-enzym Mediated Integratie en nucleaire transplantatie

Summary

Deze video toont een protocol methode voor het genereren van transgene

Abstract

Stabiele integratie van gekloonde gen producten in de Xenopus genoom is nodig om de tijd en plaats van meningsuiting controle, om genen te uiten in een later stadium van de embryonale ontwikkeling, en om te bepalen hoe enhancers en initiatiefnemers van genexpressie reguleren binnen het embryo. Het protocol blijkt hier kan gebruikt worden om efficiënt te produceren transgene Xenopus laevis embryo's. Deze transgenese wordt in drie delen: 1. Spermakernen zijn geïsoleerd van volwassen X. laevis testis door behandeling met lysolecithin, waarbij het ​​sperma plasmamembraan permeabilizes. 2. Ei extract wordt bereid door lage snelheid centrifugeren, toevoeging van calcium aan het extract zorgen om de voortgang te interfase van de celcyclus, en een high-speed centrifugatie om interfase cytosol isoleren. 3. Nucleaire transplantatie: de kernen en extract worden gecombineerd met de gelineariseerde plasmide DNA worden ingevoerd als het transgen en een kleine hoeveelheid van de restrictie-enzym. Tijdens een korte reactie, ei-extract decondenses gedeeltelijk het sperma chromatine en de restrictie-enzym genereert chromosomale breekt dat recombinatie van het transgen te bevorderen in het genoom. De behandelde spermakernen worden vervolgens getransplanteerd in onbevruchte eieren. Integratie van het transgen gebeurt meestal voorafgaand aan de eerste embryonale klieving zodanig dat de ontstane embryo's niet chimerisch zijn. Deze embryo's kunnen worden geanalyseerd zonder dat te fokken voor de volgende generatie, waardoor een efficiënte en snelle generatie van transgene embryo's voor analyses van de promotor en gen functie. Volwassen X. laevis als gevolg van deze procedure ook propageren het transgen door de kiembaan en kan gebruikt worden om lijnen van transgene dieren voor meerdere doeleinden te genereren.

Protocol

Gewijzigde versies van deze transgenese aanpak werden in eerste instantie beschreven in ¹ en ^2.

A. spermakernen voorbereiding

Deze kernen bereidingsmethode is een bewerking van Murray ^3, maar de proteaseremmers zijn weggelaten omdat ze interfereren met verdere ontwikkeling van eieren getransplanteerd met sperma kernen. Porties worden ingevroren bij -80 ° C en kan gebruikt worden voor transplantaties voor ongeveer 6 maanden.

Alle oplossingen moeten worden voorbereid en op ijs geplaatst voorafgaand aan het begin van de voorbereiding.

1. Verdoven 1-2 volwassen mannelijke X. laevis door onderdompeling in tricaïne ten minste 20 minuten gevolgd door een pithing, verwijder de testikels.
2. Rol de testes op een papieren handdoek om het bloed, de bloedvaten en vet lichaam te verwijderen, kort was ze in een 60 mm petrischaal met 1XMMR, en eventuele aanvullende stukken vet lichaam te verwijderen. Zorg ervoor dat u doorboren van de testes, omdat dit releases het sperma.
3. Overdracht testes een droge 60-mm petrischaal en maceraat testikels met een pincet totdat er geen zichtbare stukjes. Maceratie dient zo goed mogelijk gedaan worden om hoge opbrengsten van de kernen te verkrijgen.
4. Voeg 2mLs koude nucleaire voorbereiding buffer (NPB, 1X uit voorraad) om het maceraat en voorzichtig pipet op en neer.
5. Squirt maceraat door ongeveer 4 diktes van kaasdoek op een trechter, het verzamelen van in een 15 ml buis (bijv. Falcon 2059); Spoel schotel met 8mLs van de NPB en zet deze spoel door de kaasdoek, het verzamelen van het in de buis. Met handschoenen aan knijp de kaasdoek om de resterende vloeistof op te vangen in de buis.
6. Pellet het sperma bij 3000 rpm gedurende 10 minuten. bij 4 ° C in een swingende emmer rotor (bijv. 1480g in een Sorvall HB-4 rotor of equivalent) met de juiste buis adapters. Decanteer supernatant, voeg 8 ml NPB aan deze buis en pipet op en neer met een 10 ml pipet op hersuspenderen pellet; weer spin down zoals hierboven en decanteer supernatant. Equilibreren 1 ml NPB op kamertemperatuur gedurende de spin.
7. Resuspendeer pellet in 1 ml kamertemperatuur NPB met behulp van een 1 ml pipetteman tip, voeg 50μl van 10mg/mL vers gemaakte lysolecithin, meng voorzichtig, en incubeer gedurende 5 minuten. bij kamertemperatuur.
8. Voeg 10 ml koud 1XNPB +3% BSA op de buis om de lysolecithin reactie te stoppen, meng, en naar beneden draaien gedurende 10 min bij 3000 rpm in een swingende emmer rotor. Decanteren supernatant. De lysolecithin behandelde pellet eruit moet zien iets meer doorschijnend (minder ondoorzichtig wit) dan wel voorafgaand aan de lysolecithin behandeling.
9. Decanteer supernatans en resuspendeer pellet in 5 ml koud NPB +0.3% BSA, meng voorzichtig met een pipet van 10 ml en spin down gedurende 10 min bij 3000rpm, zoals hierboven.
10. Decanteer supernatant en resuspendeer pellet in 500μl van sperma opslagbuffer en over te dragen aan een 1,5 mL buis. Dit is nu uw kernen voorraad. Op te slaan op het ijs, terwijl u de opbrengst van de kernen.
11. Om de opbrengst van de kernen controleren, plaats 98 ul van sperma verdunningsbuffer (SDB), 1 ui van de nucleaire voorraad en 1μl van 1:100 verdunning van de Hoechst voorraad in een 1,5 ml Eppendorf buis. Meng de nucleaire voorraad heel goed met behulp van een scheermes-afgekapt (of grote opening) pipetpunt net voor het verwijderen van de 1 pl. Meng de verdunde SDB / Hoechst / kernen zeer goed en laat een klein bedrag aan stroom in de kamer van een verbeterde Neubauer hemacytometer door capillaire werking. Count kernen in een vierkant van de hemacytometer onder een samengestelde microscoop. Van een man is, moet u verkrijgen telt van ten minste 100 tot 200 (X10 ⁴ cellen / ml) voor deze 1:100 verdunning van de voorraad voor een onverdunde voorraad concentratie van 1-2x10 ⁵ cellen / ul. Als uw voorraad is minder geconcentreerd, laat de kernen regelen voor enkele uren, verwijdert u een aantal van de bovenstaande vloeistof, en vertellen. Laat de kernen bij 4 ° C gedurende de nacht om de glycerol te dringen voor een betere cryopreservatie, daarna goed mengen van de nucleaire voorraad met een grote opening pipetpunt, voor te bereiden 20μl aliquots, en vries in vloeibare stikstof.

B. Bereiding van High Speed ​​Extract

Deze methode is een bewerking van Murray ³ en produceert een interfase cytosolische extract dat zwelling en gedeeltelijke chromatine decondensation van toegevoegde spermakernen zal bevorderen. Extract kan worden ingevroren in kleine porties bij -80 ° C en ontdooid voor gebruik.

1. 3-5 dagen voorafgaand aan de HCG injectie, eerste 8-12 volwassen vrouwtje X. laevis door het injecteren van 50 U van PMSG in het dorsale lymfe zak. De avond voor extract voorbereiding, injecteer elke kikker met 500 eenheden HCG en plaats twee kikkers / container in 2 liter 1XMMR. Aangezien een kikker met lyseren of het activeren van eieren in gevaar kunnen brengen het uittreksel voorbereiding, is het raadzaam om kikkers scheiden in paren voor de ovulatie.
2. De volgende ochtend, voor te bereiden en chillen alle oplossingen voor het begin van de voorbereiding. Voorzichtig, met de hand te verdrijven eieren van elke kikker in grote beakers met 1X MMR. Het scherm van de eieren van elke container en laten alle partijen eieren met tekenen van vlekken, lyseren of activering (gevisualiseerd door contractie van pigmentatie in het dier halfrond) van de procedure. Verzamel ongebroken eieren met nog pigmentatie. Goede eieren kunnen ook worden afgehaald bij de 1X MMR in de kikker emmers. Het totale volume van de eieren> 100 ml vanaf de 8-12 vrouwtjes.
3. De-gelei de eieren. Om dit te doen, verwijder zo veel mogelijk te MMR, voeg dan een kleine hoeveelheid cysteïne-oplossing, en schud de eieren. Vervangen met verse cysteine ​​oplossing meerdere malen tijdens de-Gelerende. De-gelei elke partij van de eieren los en gooi deze weg batches met een breuk of ei activering. Combineer de rest van de eieren.
4. Was de eieren vier keer in ~ 35 ml van het extract buffer (XB), en vervolgens twee keer in 25 ml van de KVP-XB met proteaseremmers.
5. Om de eieren pakket: de overdracht van de eieren in Beckman UltraClear buizen. Laat de eieren om zich te vestigen. Verwijder zo veel CSF-XB mogelijk te maken. Centrifugeer de eieren met behulp van een Beekman SW 40 Ti rotor (of soortgelijke rotor) bij 1000 tpm (150 g) voor ~ 60 sec bij 4 ° C. Verwijder overtollige oplossing uit de top van de verpakte eieren.
6. Om de eieren te verpletteren en het genereren van cytoplasmatisch extract: centrifuge de eieren bij 10.000 toeren per minuut (16.000 g) gedurende 10 min bij 4 ° C. De eieren moeten afzonderlijke in drie lagen: lipide (boven), cytoplasma (midden), en de dooier (onder). Verzamel de cytoplasmatisch laag van elk buisje met een 18-gauge naald door het inbrengen van de naald door de buis aan de voet van de cytoplasmatische laag. Overdracht van het cytoplasma naar een nieuwe UltraClear Beekman buis op ijs.
7. Voeg protease remmers aan de geïsoleerde cytoplasma naar een uiteindelijke concentratie van 1X. Recentrifuge het cytoplasma bij 16.000 g gedurende 10 min bij 4 ° C. Verzamel de verduidelijkt cytoplasma zoals hierboven beschreven. Verwachten 0,75-1 ml cytoplasma / kikker te verkrijgen.
8. Voeg 1 / 20 van het extract volume van de energiemix voor het monster. Breng de cytoplasma in dikwandige polycarbonaat buizen voor de Beckman TL-100 ultracentrifuge. Buizen houden ongeveer 3 ml per stuk en moet ten minste de helft vol.
9. Voeg een M CaCl ₂ aan elke buis tot een uiteindelijke concentratie van 0,4 mM. Incubeer de buizen gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Dit inactiveert CSF en duwt het extract in de interfase.
10. Balans van de buizen en centrifuge ze in een Beekman TL-100 ultracentrifuge met behulp van een TLA-100.3 rotor bij 70.000 toeren per minuut (200.000 g) gedurende 1,5 uur bij 4 ° C. Het cytoplasma wordt fractioneren in vier lagen, boven naar beneden: lipide, cytosol, membraan / mitochondria, en glycogeen / ribosomen.
11. Haal de cytosolische laag van elk buisje (~ 1 ml of 2-3 ml werd geladen in de buis) door het invoegen van een injectiespuit in de bovenkant van de buis door de lipide laag. Breng de cytosolische fractie in de frisse buizen en recentrifuge de monsters bij 70.000 toeren per minuut (200.000 g) gedurende 20 min bij 4 ° C.
12. Aliquot het supernatant in 25-ul monsters in 0,5 ml-buizen. Quick-bevriezing van de monsters in vloeibare stikstof en bewaar bij -80 ° C tot gebruik. Om te bepalen of het extract effectief is, kunnen zaadcellen kernen worden geïncubeerd in het extract en gekleurd met Hoechst om te bepalen of de kernen zichtbaar zwellen (dikker en langer) binnen 10 minuten van de toevoeging bij kamertemperatuur.

C. Transgenese reactie en celkerntransplantatie

Belangrijk: Controleer of de oplossingen, de uitrusting en de kikkers allemaal klaar zijn voordat u een reactie. Als je eenmaal begint, moet u verdergaan met de reactie van het gebruik van de indicatief tijdschema hieronder beschreven, omdat veel onderdelen niet stabiel blijven voor> 30 minuten. Terwijl de spermakernen voorraad wordt gehouden op ijs, moet transgenese reacties (zowel verdund en geconcentreerd) worden bewaard bij kamertemperatuur.

1. Prime vrouwelijke kikkers. De avond voor transgenese, injecteren meerdere (3-5) volwassen vrouwtjes kikker met 800 eenheden HCG in de dorsale lymfe zak met vers gelegde eieren het begin van de volgende dag te verkrijgen.
2. De dag van de transgenese procedure, voor te bereiden of te brengen om de temperatuur van de oplossingen die nodig zijn voor de transgenese:
   1. Vers gemaakte cysteïne (2,5% in 1XMMR, pH8.0). U moet enkele honderden milliliters om gebruikt te worden die dag.
   2. 0.2XMMR +6% Ficoll voor transplantatie gerechten en het herstel van transgene embryo's en 0.2XMMR +100 ug / ml gentamicine (zonder Ficoll) voor het verhogen van embryo's. Oplossingen mogen niet warmer dan 18-21 ° C en transgene embryo's moeten worden verhoogd door vroege breuklijnen bij temperaturen tussen 16 en 21 ° C, omdat hogere temperaturen negatief zowel de frequentie van transgenese en de embryonale ontwikkeling beïnvloeden.
   3. Ontdooien en op kamertemperatuur bevroren monsters van SDB (sperma verdunning buffer) voor transplantaties van de dag, dooi de hoge snelheid toe en plaats het op ijs, en bereiden een 100mm MgCl _2-oplossing.
   4. Stap uit ee agarose injectie gerechten en vullen met MMR / Ficoll-oplossing, en het opzetten en pre-run de infusiepomp om de stroom te stabiliseren.
   5. Controleer of de vrouwelijke kikkers zijn leggen en de eieren zijn van hoge kwaliteit. Optimaal, moeten de eieren hebben een stevige cortex (houd vorm na de-Gelerende).
3. Het opzetten van een transgenese reactie:
   1. Heel voorzichtig (met behulp van een afgesneden pipettip) meng de kernen voorraad en combineren in een 1,5 ml Eppendorf buis:
      4μl kernen (~ 4-8X10 ^vijf kernen)
      2μl gelineariseerd plasmide (100ng/μl)
      Incubeer 5 minuten bij kamertemperatuur.
   2. terwijl de incubatie verloopt, verdunnen 0.5μl van restrictie-enzym in 4.5μl H ₂ O en voeg 1μl van verdunde enzym om 18μl van SDB, 2μl van MgCl ₂ en 2μl van hoge snelheid te halen. Voeg dit mengsel bij de kernen-plasmide reactie. Incubeer 10 minuten naar de kernen zwellen.
   3. Tijdens deze incubatie, knijp eieren 2-3 kikkers en de-gelei in cysteïne oplossing. Was ze goed (5x) met 1XMMR, en gebruik een wijde boring pipet 400-500 dejellied eieren over te dragen aan elke agarose goed schotel met 0,2 x BMR +4% Ficoll. Dit duurt meestal ongeveer 10 minuten, eens zo ei-gerechten zijn bereid reactie is meestal klaar om te verdunnen.
   4. Ongeveer 15-20 minuten na het starten van een stap, voorzichtig de reactie (kernen / extract / DNA) te mengen met een geschoren tip en ongeveer 5μl tot 150 ul SDB bij kamertemperatuur toe te voegen. Kernen in deze verdunde mengsel stabiel zijn voor ongeveer 1 uur., Terwijl ze transplantatie capaciteit niet behouden zo lang als links in de geconcentreerde mengsel.
4. Laad de naald: Mix de verdunde reactie bereid hiervoor heel voorzichtig met een brede opening pipetpunt, dan is meteen last van de naald, als kern snel zal vestigen in de buis. Lijken de de naald, een stukje van fijne Tygon slang op het einde van een geschoren 200μl pipetpunt. Zuig de oplossing in de pipetpunt, dan bevestig de slang aan op de naald en laat de oplossing van de naald in te voeren door de zwaartekracht of voorzichtig indrukken van de pipet zuiger.
5. Bevestig de naald aan de pomp en slang transplantaties van de kernen te beginnen. Injecties moeten worden snelle, oppervlakkige en ongeveer loodrecht op het plasma van de eicel van de membraan om te voorkomen dat schade aanricht. Aan de snelheid van stroming voorgesteld (10nl/sec), houd de naald in het ei voor ~ 0.5 seconden. Je moet compleet 1-2 gerechten van transplantaties binnen 20-30 minuten.

Na de injecties, laat de gerechten bij 16-20 ° C tot embryo's hebben bereikt de 4-8 cellig stadium. Sorteer de splijten embryo's uit de buurt van hun niet-splitsen van de buren door de overdracht van (met een glas Pasteur pipet met een tip ongeveer dezelfde diameter als een ei) om een ​​nieuwe grote schotel 0.2XMMR +4% Ficoll. Onderverdelen van de embryo's splijten in kleinere groepen (10-15 embryo's / putje van een 6-wells plaat) en cultuur in 0.2XMMR (geen Ficoll) +100 ug / ml gentamicine via de vroege ontwikkeling. Embryo's moet worden gecontroleerd tijdens de gastrulatie met een stervende embryo's onmiddellijk verwijderd en veranderde de media als dat nodig is.

Problemen oplossen:

1. Naald is geblokkeerd: oplossing vloeien voort uit de naald moet blijken tijdens de transplantaties. Als de naald verstopt raakt door zichtbare deeltjes, wijzigen naalden of proberen om het puin te verwijderen door het knippen van de tip met een tang en duwen oplossing door de naald.
2. Geen klieven eieren zijn verkregen: controleer of verdunningen van sperma kernen en injectievolume geschikt is en dat de naald was niet geblokkeerd tijdens de transplantatie. Als injectie volume te hoog is, kunnen eieren ook niet hechten en in plaats daarvan tonen verkleurd pigmentatie of schade.
3. Veel embryo's sterven tijdens de gastrulatie. Verschillende factoren kunnen verbeteren embryo's overleven:
   1. Wees voorzichtig met de kernen tijdens de voorbereiding en de enzymatische reactie. Decondensed kernen zijn kwetsbaar en moeten worden getransplanteerd met behulp van het tijdschema hierboven. Plaats ze niet op ijs.
   2. De chromosomale schade die het sperma kernen tijdens de enzym reactie en nucleaire transfer van invloed op zowel de frequentie van transgenese en de normale ontwikkeling van embryo's. Chromosomale beschadiging van de kernen verbetert de efficiëntie van transgenese, maar een negatieve invloed op overleving / normale ontwikkeling. Verminderen of weglaten van restrictie-enzym tijdens het enzym incubatie kan de snelheid van een normale ontwikkeling, maar kan de frequentie van transgenese of plasmide copy number ingebracht in de embryo genoom te verlagen.
   3. Als late blastula door gastrula embryo's vertonen tekenen van verkleuring of celdood is het ook mogelijk dat een reagens dat wordt gebruikt voor de transplantaties was toxisch voor de eieren. Bovendien, als eis niet een vaste cortex hebben, kunnen ze ondergaan exogastrulation en niet om de normale post-gastrula embryo's te genereren.
4. Het aantal embryo's de uiting van de transgen is laag. Verhoog de hoeveelheid restrictie-enzym.

Vertegenwoordiger Transgene Embryo resultaten

Transgene embryo's als gevolg van nucleaire transfers moet worden verhoogd tot expressie van de promoter van belang is te zien. In figuur 1 hierboven, een spier actine-promotor rijdt de expressie van groen fluorescent eiwit in de somieten van deze transgene kikkervisje.

Discussion

Voor elke transgene construct te testen, hebben we over het algemeen transplantatie kernen in 500-1000 eieren, op deze schaal, kunnen we het genereren van transgene embryo's uitdrukken tot 10 verschillende constructen per dag, afhankelijk van het aantal vrouwtjes worden aangezet om eieren te leggen. Van deze transplantaties, ongeveer een derde van de eieren aankleven en 60-80% van deze embryo's splitsen normaal verder door gastrulatie. Afhankelijk van de gebruikte reactie-omstandigheden, tussen de 10-50% van deze embryo's uitdrukkelijke het transgen van belang. Daarom, zodra deze procedure is gevestigd in het laboratorium, is het mogelijk dat een werknemer te creëren populaties van transgene embryo's expressie brengen van een aantal verschillende plasmiden in een enkele dag. Transgenen te integreren in het genoom als een concatemer (5-35 kopieën), dus deze methode kan ook gebruikt worden om meer dan een verschillende transgene cointegrate in het genoom van een embryo bij een hoge frequentie (80-90%) ^4.

De transgenese hier beschreven aanpak met succes is gebruikt om de genen van belang misexpress, om genregulatie bestuderen, en om embryo's die een marker / fluorescerende reporter in cellen of structuren van belang (bijvoorbeeld ^4-7) te drukken te genereren. Transgenen zijn verspreid door de kiembaan ^8. Tot slot, hoewel de procedure is aangetoond voor gebruik met Xenopus laevis hier, is het ook al aangepast voor gebruik in de gerelateerde diploïde soort, Xenopus tropicalis ^9.

Materials

A.Sperm nuclei preparation

Reagents:

1X MMR (2mM CaCl2, 5mM HEPES, pH7.5, 2mM KCl, 1mM MgCl2, 100mM NaCl). 0.1% Tricaine Methanesulfonate (MS222, aminobenzoic acid ethyl ester, Sigma A-5040), 0.1% sodium bicarbonate. Dissolve in water. 2X Nuclear Preparation Butter (NPB). On the day of the sperm nuclei preparation, make up 30 ml of 2X NPB from aliquots of the stock solutions stored frozen: 500 mM sucrose (1.5 M stock), 30 mM HEPES (1M stock; titrate with KOH so that pH 7.7 is at 15 mM), 1 mM spermidine trihydrochloride (Sigma S-2501; 10 mM stock), 0.4 mM spermine tetrahydrochloride (Sigma S-1141; 10 mM stock), 2 mM dithiothreitol (Sigma D-0632; 100 mM stock), 2 mM EDTA (500 mM EDTA, pH 8.0). Use the 2XNPB to make a. 30ml 1X NPB, b. 10ml 1XNPB+3%BSA (fraction V, Sigma A-7906), c. 5ml 1XNPB+0.3%BSA. Lysolecithin: 100 μl of 10 mg/ml L-α-lyso-Lecithin, Egg Yolk (Calbiochem, 440154); dissolve at room temperature just before use. Store solid stock at 20 °C. Discard the stock powder if it becomes sticky. Bovine serum albumin (BSA): 10% (w/v) BSA (fraction V, Sigma A-7906) Make up 5 ml in water on the day of the sperm nuclei preparation. Sperm storage buffer (1ml) 1X NPB, 30% glycerol, 0.3% BSA. Sperm dilution buffer: 250 mM sucrose, 75 mM KCl, 0.5 mM spermidine trihydrochloride, 0.2 mM spermine tetrahydrochloride. Titrate to pH 7.3-7.5 and store 0.5-1 ml aliquots at 20 °C. H–chst No. 33342 (Sigma B-2261): 10 mg/ml stock in dH2O, store in a light tight vessel at 20 °C.

Equipment:

Swinging bucket rotor and centrifuge cheesecloth dissection tools (forceps and scissors) fluorescence microscope funnel gloves hemocytometer needles (26 gauge) paper towels petri dishes (60 mm) pipettes plastic (5 and 10 ml) Pipetman tips (1 ml and 200μl) Syringes (1 ml) tubes (14 ml; Falcon, 2059) tubes microcentrifuge (1.5 ml)

B. Preparation of High Speed Extract

Reagents:

1X Marc's Modified Ringer (MMR): 100 mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 5 mM HEPES, pH 7.5. Prepare a 10X stock, and adjust pH with NaOH to 7.5. 20X Extract buffer (XB) salt stock: 2 M KCl, 20 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, filter-sterilize and store at 4 °C. Extract buffer (XB; freshly prepared and stored on ice): 1X XB salts, 50 mM sucrose,10mM HEPES (1 M stock, titrated with KOH so that pH is 7.7 when diluted to 15 mM; filter-sterilize, and store in aliquots at 20 °C). Prepare about 100 ml. 2% (w/v) L-Cysteine hydrochloride 1-hydrate: Made up in 1X XB salts before use and titrated to pH 7.8 with NaOH. Prepare about 300 ml. CSF-XB: 1X XB salts, 1 mM MgCl2 (in addition to MgCl2 present in XB salts; final concentration 2 mM), 10 mM HEPES, pH 7.7, 50 mM sucrose, 5 mM EGTA, pH 7.7. Prepare 50 ml. Protease inhibitors: Mixture of leupeptin, chymostatin, and pepstatin, each dissolved to a final concentration of 10 mg/ml in dimethyl sulfoxide (DMSO). Store in small aliquots at 20 °C. 1 M CaCl2. Energy mix: 150 mM creatine phosphate, 20 mM ATP, 20 mM MgCl2. Pregnant Mare Serum Gonadotropin (PMSG): 100 U/ml PMSG (P.G.600®, Intervet, Inc., 021825). Dissolve in water and stored at 20 °C. Human Chorionic Gonadotropin (HCG): 1000 U/ml HCG (CHORULON®, Intervet, Inc., 057176 ). Dissolve in water and stored at 4 °C.

Equipment:

Xenopus laevis females Needles (18 and 26 gauge) Pasteur pipette wide bore Syringes (1 mL) Tubes, microcentrifuge (0.5 mL) Tubes, thick-wall polycarbonate (Beckman, 349622) Tubes, ultraclear (14 x 95 mm; Beckman, 344060) Ultracentrifuge and rotors (e.g., Beckman TL-100 with rotors SW 40 Ti and TLA-100.3) Beakers for egg collection Buckets or containers for holding female frogs (e.g., 4-L plastic beakers with mesh lids).

C. Nuclear transplantation.

Reagents:

2.5% agarose in 0.1XMMR (for making injection dishes) 2.5% Cysteine in 1XMMR, pH8.0, prepared on the day of use Ficoll 10 mg/ml gentamycin (1000X stock) high speed egg extract (see above) 100 MgCl2 10X MMR (see above) Restriction enzyme (e.g. NotI from New England Biolabs) Sperm dilution buffer (SDB; see above) and sperm nuclei (see above) Human Chorionic Gonadotropin (HCG) as above mineral oil (Sigma, M8410) Linearized plasmid to be introduced as the transgene: Prepare linearized plasmid at a concentration of about 100 ng/μl in sterile, nuclease-free water (we avoid Tris and EDTA-containing buffers, which are somewhat toxic to embryos). The restriction enzyme used to linearize the plasmid d–s not have to be the same as the one used in the nuclear transfer reaction. We usually use NotI for all reactions, regardless of what plasmid is linearized with. Some calibration of the enzyme dilution used in the reaction may be necessary, as too much enzyme can cause adverse effects on post-gastrula development. Plasmid can be purified in several different ways: we usually use the Qiagen Qiaquick PCR purification kit according to the manufacturers directions; purification of a single band from a gel is not necessary. If plasmid is purified using phenol/chloroform extractions and ethanol precipitation, be certain to remove all traces of organics and ethanol.

Equipment:

Agarose dishes for injection: In a 60 mm plastic petri dish, lay a small 35mmX35mm weigh boat on molten 2.5% agarose in water 0.1XMMR to create a depression with an agarose-coated bottom for filling with eggs. Once agarose has hardened, wrap in parafilm and store at 4 °C until use. Make 2-3 dishes in advance for each transgenic reaction you plan to do.

Infusion pump: We use a single syringe infusion pump from Harvard Apparatus, equipped with a 3 cc syringe/needle filled with mineral oil (Sigma M-8410). Blunt the syringe needle tip (to keep it from perforating the tubing) and attach the fine tygon tubing. Run the pump at ~10nl/sec; this assumes that the time the needle is in each egg will be no greater than 1 sec. Pump should be pre-run for several minutes prior to starting transgenesis for the day to assure that the plunger for the syringe is flush with the piston and that steady positive flow of oil out of the tubing is occurring.

Needles for nuclear transfers. Using a micropipette puller, generate needles with long, sloping tips. Clip these with a forcep under a dissecting microscope equipped with an ocular micrometer to obtain an ~80 micron opening with a beveled shape.

Other equipment: Xenopus laevis females, stereomicroscope, incubator, micromanipulator, microinjection needle puller (e.g. Model P-87, Sutter), syringe needles (26 gauge), glass microinjection needles, ocular micrometer for calibrated clipping of microinjection needle tips to 80μm diameter, petri dishes, weigh boats 35mm, Tygon tubing (ID=1/32 in., OD=3/32 in.)