دروسوفيلا تشريح الغدة الملحقات الذكور: طريقة لعزل الخلايا الثانوية

Overview

يصف هذا الفيديو تشريح الغدد الملحقة من الذباب الذكري ويظهر مثالا يتم فيه فصل الغدة المعزولة إلى تعليق خلية واحدة.

Protocol

هذا البروتوكول هو مقتطف من Immarigeon وآخرون، بروتوكول يستند إلى FACS لعزل الحمض النووي الريبي من الخلايا الثانوية للغدد الملحقة الذكور Drosophila ، J. Vis. Exp. (2019).

1. الحلول وإعداد المواد

1. قم بإعداد الحلول التالية.
   1. إعداد مصل تستكمل المتوسطة (SSM): شنايدر Drosophila المتوسطة تكملها 10٪ الحرارة المعطل مصل البقر الجنين و 1٪ البنسلين-Streptomycin.
   2. إعداد aliquots من إنزيم تريبسين 1x (على سبيل المثال، TrypLE Express Enzyme) وتخزينها في درجة حرارة الغرفة.
   3. إعداد aliquots من papain [50 U / مل] (المخزنة في -20 درجة مئوية وذاب مرة واحدة فقط).
   4. إعداد 1x الفوسفات العازلة المالحة (PBS، المخزنة في درجة حرارة الغرفة).
2. إعداد نصائح متعددة لهب مدورة pipet للتفكك الجسدي للغدد الملحقة.
   ملاحظة: استخدام نصائح الاحتفاظ منخفضة للتعامل مع الغدد الملحقة لأنها تميل إلى الالتزام البلاستيك غير المعالجة. عملية التقريب اللهب يقلل من فتح تلميح وينعم حواف الطرف. وهذا يضمن التفكك الفعال بعد الهضم peptidase دون قص أغشية الخلايا.
   1. قطع طرف واحد 200 ميكرولتر مع شفرة حادة وتمريره بلطف على لهب لجولة من طرفها بحيث فتح أوسع ولكن على نحو سلس للتعامل معها خلال الخطوة 2.7.
   2. تضييق فتح نصائح متعددة 1000 ميكرولتر عن طريق تمرير فتح طرف بالقرب من لهب لمدة تقل عن ثانية واحدة. تدوير طرف قليلا لتجنب الإفراط في ذوبان أو انسداد. فرز النصائح المصنوعة من أضيق إلى أوسع. ويمكن القيام بذلك عن طريق توقيت سرعة الطموح. في محاولة لتفكيك عينة صغيرة الحجم من AGs لاختبار كفاءة أضيق النصائح.
      ملاحظة: هذه النصائح حاسمة للهياج الميكانيكي. تسمح نصائح الأنابيب ذات الجودة المستديرة باللهب بالتفكك الكامل مع الحفاظ على صلاحية الخلية. على هذا النحو، يتم غسل هذه النصائح جيدا بالماء في نهاية الإجراء لإعادة استخدامها. وهذا يسمح للتفكك يوما بعد يوم استنساخها.

2. تشريح الغدد الملحقة

1. وضع 20 إلى 25 Drosophila الذكور في طبق زجاجي على الجليد.
2. تشريح ذكر واحد في SSM. خلع الجهاز التناسلي ومسح الزوج الغدة التبعي من جميع الأنسجة الأخرى وبصرف النظر عن القناة القذفية.
   ملاحظة: إزالة الخصيتين لأن الحيوانات المنوية الصادرة يمكن أن تخلق كتل وتعكر صفو عملية الانفصال. إزالة لمبة القذف، مما يجعل من الصعب التعامل معها عندما يطفو.
3. مع ملقط، نقل الغدد التبعي إلى لوحة زجاجية مليئة SSM في درجة حرارة الغرفة. كرر الخطوات 2.2-2.3 مرات 20 للحصول على دفعة من 20 زوجا من الغدد في SSM.
   ملاحظة: سيتم تحقيق هذه الخطوات في 15 إلى 20 دقيقة. يجب أن تبدو AGs صحية ، ويجب أن تكون الحركات التجهرية لطبقة العضلات حول الغدد مرئية. يمكن مراقبة GFP باستخدام المجهر الفلوري.
4. نقل الغدد الملحقة إلى برنامج تلفزيوني 1x لغسل 1-2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
   ملاحظة: من أجل تفكك أفضل ، من الضروري شطف الغدد مع برنامج تلفزيوني. مدة هذه الخطوة، ومع ذلك، ينبغي أن تكون محدودة كما تظهر الخلايا علامات الإجهاد في برنامج تلفزيوني. الخلايا الثانوية فصلت في برنامج تلفزيوني تنتفخ بسرعة ويموت.
5. تمييع 20 ميكرولتر باباين [50 U/mL] إلى 180 ميكرولتر من إنزيم 1x تريبسين للحصول على محلول التفكك (لتوسيع نطاق أو خفض الحفاظ على 9 ميكرولتر من إنزيم تريبسين و 1 ميكرولتر من الباباين لكل ذكر). مع ملقط، نقل الغدد الملحقة لهذا الحل.
6. عزل غيض من الغدد الملحقة (التي تحتوي على خلايا ثانوية) من الجزء القريب. استخدام ملقط غرامة لقرصة بقوة في منتصف الفص الغدي وقطع مع غيض حاد من ملقط الثاني. قم بإزالة الجزء القريب من الغدد الملحقة والقناة القذفية لتحسين التفكك وتقليل وقت فرز الخلايا.
   ملاحظة: تشريح الجزء القاصي من 20 زوجا من الغدد سوف يستغرق 15 إلى 20 دقيقة والهضم عن طريق peptidases وبالتالي سوف تبدأ في درجة حرارة الغرفة.
7. بعد تشريح جميع نصائح الغدة، نقلها إلى أنبوب 1.5 مل باستخدام تلميح ماصة خاصة 200 ميكرولتر أعدت في الخطوة 1.2.1. وينبغي أن تكون واسعة, تقريب والرطب قبل التعامل مع الغدد.
   ملاحظة: لأنسجة الغدة الملحقات pipet، يجب أن تكون النصائح دائما قبل الرطب مع الحل المناسب (إنزيم تريبسين أو SSM، والحفاظ على أنبوب واحد من كل لهذا الغرض). شطف بعناية نصائح بين العينات لتجنب التلوث.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Binocular microscope for dissection
Binocular with light source for GFP
Bunsen
Plastic microtubes 1.5 mL	Eppendorf
Fine dissection forceps
Foetal bovine serum	Gibco	10270-106	heat inactivated prior to use
Glass dishes for dissection
Ice bucket
P1000	Gilson
P20	Gilson
P200	Gilson
Papain			50U/mL stock
PBS			home made
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15070-063
Schneider’s Drosophila medium	Gibco	21720-001
Tipone 1250 μL graduated tip	Starlab	S1161-1820
Tipone 200 μL bevelled tip	Starlab	S1161-1800
TrypLE Express Enzyme	Gibco	12604013