דרוזופילה (לא כולל) ניתוח בלוטת אביזר זכר: שיטה לבודד תאים משניים

Overview

וידאו זה מתאר את הניתוח של בלוטות האביזר מזבובים זכרים ומראה דוגמה שבה הבלוטה המבודדת תהיה מנותקת לתוך השעיה תא יחיד.

Protocol

פרוטוקול זה הוא קטע מתוך Immarigeon et al., פרוטוקול מבוסס FACS כדי לבודד RNA מן התאים המשניים של בלוטות עזר זכר Drosophila, J. Vis. Exp. (2019).

1. פתרונות והכנת חומרים

1. הכן את הפתרונות הבאים.
   1. הכן סרום בתוספת בינוני (SSM): מדיום דרוזופילה של שניידר משלים עם 10% חום מומת סרום שור עוברי מומת ו 1% פניצילין-סטרפטומיצין.
   2. הכינו aliquots של אנזים טריפסין 1x (למשל, טריפל אקספרס אנזים) ולאחסן בטמפרטורת החדר.
   3. הכן aliquots של פפאין [50 U / mL] (מאוחסן ב -20 מעלות צלזיוס והפשיר רק פעם אחת).
   4. הכן מלוחים 1x פוספט מאגר (PBS, מאוחסן בטמפרטורת החדר).
2. הכן טיפים מרובים צינורות מעוגלים להבה עבור ניתוק פיזי של בלוטות אביזר.
   שים לב: השתמש טיפים שמירה נמוכה לטיפול בלוטות עזר כפי שהם נוטים לדבוק פלסטיק מטופל. תהליך עיגול הלהבות מפחית את פתח הקצה ומחליק את קצות הקצה. זה מבטיח דיסוציאציה יעילה לאחר עיכול פפטידאז מבלי גזירה קרום התא.
   1. חותכים קצה אחד 200 μL עם להב חד בעדינות להעביר אותו על להבה כדי לעגל את הקצה שלה, כך הפתח הוא רחב יותר אך חלק לטיפול במהלך שלב 2.7.
   2. לצמצם את הפתיחה של כמה 1,000 טיפים μL על ידי העברת קצה פתיחת ליד להבה במשך פחות משנייה אחת. סובב מעט את הקצה כדי להימנע מהמסת יתר או מסתימת יתר. מיין את העצות העשויות מצרות לרחבות יותר. זה יכול להיעשות על ידי תזמון מהירות השאיפה. נסה לנתק מדגם בקנה מידה קטן של AGs כדי לבדוק את היעילות של הטיפים הצרים ביותר.
      שים לב: טיפים אלה הם קריטיים עבור תסיסה מכנית. טיפים איכותיים לצינור מעוגל להבה מאפשרים ניתוק מלא תוך שמירה על הכדאיות של התא. ככזה, טיפים אלה נשטפים ביסודיות עם מים בסוף ההליך לשימוש חוזר. זה מאפשר ניתוק יומיומי לשחזור.

2. ניתוח של בלוטות עזר

1. שים 20 עד 25 דרוזופילה זכר בצלחת זכוכית על קרח.
2. לנתח 1 זכר בSSM. להוריד את מערכת הרבייה שלה ולנקות את זוג בלוטת האביזר מכל הרקמות האחרות מלבד צינור השפיכה.
   שים לב: הסר אשכים כי הזרע ששוחרר יכול ליצור גושים להפריע לתהליך הדיסוציאציה. הסר את הנורה השפיכה, מה שהופך את הטיפול קשה כאשר הוא צף.
3. עם מלקחיים, להעביר בלוטות עזר לצלחת זכוכית מלא SSM בטמפרטורת החדר. חזור על שלבים 2.2-2.3 20 פעמים כדי לקבל אצווה של 20 זוגות של בלוטות SSM.
   שים לב: צעדים אלה יושגו בתוך 15 עד 20 דקות. AGs צריך להיראות בריא, ואת התנועות peristaltic של שכבת השריר סביב בלוטות צריך להיות גלוי. ניתן לפקח על GFP באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
4. העבר את בלוטות האביזר ל-PBS 1x לכביסה של 1-2 דקות בטמפרטורת החדר.
   שים לב: עבור דיסוציאציה טובה יותר, זה הכרחי כדי לשטוף את הבלוטות עם PBS. משך שלב זה, עם זאת, צריך להיות מוגבל כמו התאים מראים סימנים של מתח PBS; תאים משניים מנותקים ב-PBS מתנפחים ומתים במהירות.
5. לדלל 20 μL פפאין [50 U/mL] לתוך 180 μL של אנזים 1x טריפסין כדי להשיג את פתרון הדיסוציאציה (כדי להקטין למעלה או למטה לשמור 9 μL של אנזים טריפסין ו 1 μL של פפאין עבור כל זכר). עם מלקחיים, להעביר בלוטות עזר לפתרון זה.
6. לבודד את קצה בלוטות האביזר (המכיל תאים משניים) מהחלק הפרוקסימלי. השתמש מלקחיים עדינים לצבוט בחוזקה באמצע האונה הבלוטות לחתוך עם קצה חד של מלקחיים שנייה. הסר את החלק הפרוקסימלי של בלוטות האביזר ואת צינור השפיכה כדי לשפר את הדיסוציאציה ולהפחית את זמן מיון התאים.
   שים לב: ניתוח החלק הדיסטלי מ 20 זוגות של בלוטות ייקח 15 עד 20 דקות ועיכול על ידי פפטידסים ובכך יתחיל בטמפרטורת החדר.
7. לאחר כל טיפים בלוטה נותחו, להעביר אותם לתוך צינור 1.5 מ"ל באמצעות טיפ מיוחד 200 μL פיפט מוכן בשלב 1.2.1. זה צריך להיות רחב, מעוגל ורטוב לפני הטיפול בלוטות.
   שים לב: כדי צינור רקמת בלוטת אביזר, טיפים תמיד צריך להיות רטוב מראש עם פתרון מתאים (אנזים טריפסין או SSM, לשמור צינור אחד של כל למטרה זו). לשטוף בזהירות טיפים בין דגימות כדי למנוע זיהום.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Binocular microscope for dissection
Binocular with light source for GFP
Bunsen
Plastic microtubes 1.5 mL	Eppendorf
Fine dissection forceps
Foetal bovine serum	Gibco	10270-106	heat inactivated prior to use
Glass dishes for dissection
Ice bucket
P1000	Gilson
P20	Gilson
P200	Gilson
Papain			50U/mL stock
PBS			home made
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15070-063
Schneider’s Drosophila medium	Gibco	21720-001
Tipone 1250 μL graduated tip	Starlab	S1161-1820
Tipone 200 μL bevelled tip	Starlab	S1161-1800
TrypLE Express Enzyme	Gibco	12604013