Дрозофила Мужской аксессуар Гланд вскрытие: метод изоляции вторичных клеток

Overview

Это видео описывает вскрытие аксессуаров желез от самцов мух и показывает пример, в котором изолированная железа будет разобщена в одноклеточную подвеску.

Protocol

Этот протокол является выдержкой из Immarigeon и др.,FACS основе протокола по изоляции РНК из вторичных клеток Drosophila Мужской аксессуар Glands, J. Vis. Exp. (2019).

1. Решения и материальная подготовка

1. Подготовь следующие решения.
   1. Подготовка сыворотки дополнительной среды (SSM): Шнайдер в Drosophila среды дополняется 10% тепла инактивированной сыворотки крупного рогатого скота плода и 1% пенициллин-стрептомицин.
   2. Подготовка алицитов 1x трипсина фермента (например, TrypLE Экспресс фермента) и хранить при комнатной температуре.
   3. Подготовь алициты папаина (50 U/mL) (хранится при -20 градусов по Цельсию и тает только один раз).
   4. Приготовьте 1x фосфатный буферный солевой раствор (PBS, хранящийся при комнатной температуре).
2. Подготовь несколько огнеухлых пипеток для физической диссоциации аксессуаров.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте советы с низким удержанием для обработки аксессуаров желез, поскольку они, как правило, придерживаются необработанных пластиковых. Процесс округливания пламени уменьшает открытие кончика и разглаживает края кончика. Это обеспечивает эффективную диссоциацию после переваривания пептидазы без стрижки клеточных мембран.
   1. Вырезать один 200 йл наконечник с острым лезвием и осторожно передать его над пламенем, чтобы округлать его кончик так, что отверстие шире, но гладкой для обработки во время шага 2.7.
   2. Сузить отверстие нескольких 1000 йл советы, проходя кончик открытия возле пламени менее чем за одну секунду. Поверните кончик немного, чтобы избежать чрезмерного плавления или засорения. Сортировать советы, сделанные из более узких и широких. Это можно сделать путем синхронизации скорости устремления. Попробуйте разобщить небольшую выборку AGs, чтобы проверить эффективность самых узких советов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эти советы имеют решающее значение для механического возбуждения. Качество пламени округлые советы пипетки позволяют полную диссоциацию при сохранении жизнеспособности клеток. Таким образом, эти советы тщательно промывают водой в конце процедуры повторного использования. Это позволяет для изо дня в день воспроизводиться диссоциации.

2. Вскрытие аксессуаров Glands

1. Положите от 20 до 25 самцов дрозофилы в стеклянную тарелку на льду.
2. Вскрыть 1 мужчину в SSM. Смей его репродуктивного тракта и очистить пару аксессуаров железы от всех других тканей, кроме эякуляционного протока.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Удалить яички, потому что выпустила сперма может создать сгустки и нарушить процесс диссоциации. Удалите эякуляционную лампу, что затрудняет обработку, когда она плавает.
3. С помощью типсов перенесите аксессуарные железы на стеклянную пластину, наполненную SSM при комнатной температуре. Повторите шаги 2,2-2,3 20 раз, чтобы получить партию из 20 пар желез в SSM.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эти шаги будут достигнуты в 15 до 20 мин. AGs должны выглядеть здоровыми, и перистралтические движения мышечного слоя вокруг желез должны быть видны. GFP можно контролировать с помощью флуоресцентного микроскопа.
4. Передача аксессуаров желез в 1x PBS для 1-2 мин мыть при комнатной температуре.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для лучшей диссоциации, крайне важно, чтобы промыть железы с PBS. Продолжительность этого шага, однако, должна быть ограничена, как клетки показывают признаки стресса в PBS; разобщеные вторичные клетки в PBS быстро набухают и умирают.
5. Разбавить 20 мкл папаина (50 U/mL) в 180 мкл 1x трипсина фермента для получения раствора диссоциации (для масштабирования вверх или вниз держать 9 йл трипсина фермента и 1 мл папаина для каждого самца). С типсами, передача аксессуаров желез к этому решению.
6. Изолировать кончик аксессуарных желез (содержащих вторичные клетки) от проксимальной части. Используйте тонкие щипцы, чтобы крепко ущипнуть середину железистой доли и вырезать острым кончиком второго щипцы. Удалите проксимальную часть аксессуаров и эякуляционный проток, чтобы улучшить диссоциацию и сократить время сортировки клеток.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Рассечение дистальной части из 20 пар желез займет от 15 до 20 мин, а пищеварение пептидами, таким образом, начнется при комнатной температуре.
7. После того, как все кончики желез были вскрыты, перенесите их в трубку 1,5 мл с помощью специального наконечника трубы 200 МКЛ, подготовленного на шаге 1.2.1. Она должна быть широкой, округлой и влажной до обработки желез.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для трубчатой ткани аксессуаров железы, советы всегда должны быть предварительно мокрые с соответствующим раствором (трипсин фермента или SSM, держать одну трубку каждого для этой цели). Тщательно промойте кончики между образцами, чтобы избежать загрязнения.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Binocular microscope for dissection
Binocular with light source for GFP
Bunsen
Plastic microtubes 1.5 mL	Eppendorf
Fine dissection forceps
Foetal bovine serum	Gibco	10270-106	heat inactivated prior to use
Glass dishes for dissection
Ice bucket
P1000	Gilson
P20	Gilson
P200	Gilson
Papain			50U/mL stock
PBS			home made
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15070-063
Schneider’s Drosophila medium	Gibco	21720-001
Tipone 1250 μL graduated tip	Starlab	S1161-1820
Tipone 200 μL bevelled tip	Starlab	S1161-1800
TrypLE Express Enzyme	Gibco	12604013