Drosophila Dissecção da glândula de acessório masculino: um método para isolar células secundárias

Overview

Este vídeo descreve a dissecação das glândulas acessórias de moscas machos e mostra um exemplo no qual a glândula isolada será dissociada em uma única suspensão celular.

Protocol

Este protocolo é um trecho de Immarigeon et al., Um Protocolo baseado em FACS para isolar o RNA das Células Secundárias das Glândulas Acessórias Masculinas de Drosophila, J. Vis. Exp. (2019).

1. Soluções e Preparação de Materiais

1. Prepare as seguintes soluções.
   1. Prepare o soro suplementar médio (SSM): O meio de Drosophila de Schneider complementado com soro bovino fetal inativado de 10% e 1% penicilina-estreptomicina.
   2. Prepare alíquotas de enzima de trippsina de 1x (por exemplo, Enzima Expressa TrypLE) e armazene à temperatura ambiente.
   3. Prepare alíquotas de papain [50 U/mL] (armazenado a -20 °C e descongelado apenas uma vez).
   4. Prepare 1x salina tampão fosfato (PBS, armazenada à temperatura ambiente).
2. Prepare várias pontas de tubulação arredondadas para a dissociação física das glândulas acessórias.
   NOTA: Use dicas de baixa retenção para manusear glândulas acessórias, pois elas tendem a aderir ao plástico não tratado. O processo de arredondamento de chamas reduz a abertura da ponta e suaviza as bordas da ponta. Isso garante uma dissociação eficiente após a digestão da peptidase sem cisar as membranas celulares.
   1. Corte uma ponta de 200 μL com uma lâmina afiada e passe-a suavemente sobre uma chama para arredondar sua ponta para que a abertura seja mais larga, mas suave para manuseio durante a etapa 2.7.
   2. Reduza a abertura de várias pontas de 1.000 μL passando a ponta abrindo perto de uma chama por menos de um segundo. Gire ligeiramente a ponta para evitar o excesso de derretimento ou entupimento. Classifique as pontas feitas de mais estreitas para mais largas. Isso pode ser feito cronometrando a velocidade da aspiração. Tente dissociar uma pequena amostra de AGs em pequena escala para testar a eficiência das pontas mais estreitas.
      NOTA: Essas dicas são fundamentais para a agitação mecânica. As pontas de tubulação arredondadas com chamas de qualidade permitem a dissociação completa, preservando a viabilidade celular. Como tal, essas pontas são lavadas completamente com água no final do procedimento para reutilização. Isso permite a dissociação reprodutível do dia a dia.

2. Dissecção das glândulas acessórias

1. Coloque 20 a 25 drosophila macho em um prato de vidro no gelo.
2. Disseca 1 macho em SSM. Retire seu trato reprodutivo e limpe o par de glândulas acessórias de todos os outros tecidos além do ducto ejaculatório.
   NOTA: Remova os testículos porque o esperma liberado pode criar aglomerados e perturbar o processo de dissociação. Remova a lâmpada ejaculatória, o que dificulta o manuseio quando flutua.
3. Com fórceps, transfira as glândulas acessórias para uma placa de vidro cheia de SSM à temperatura ambiente. Repita as etapas 2.2-2.3 20 vezes para obter um lote de 20 pares de glândulas em SSM.
   NOTA: Essas etapas serão alcançadas em 15 a 20 minutos. Os AGs devem parecer saudáveis, e os movimentos peristálticos da camada muscular ao redor das glândulas devem ser visíveis. O GFP pode ser monitorado usando um microscópio fluorescente.
4. Transfira as glândulas acessórias para 1x PBS para uma lavagem de 1-2 minutos à temperatura ambiente.
   NOTA: Para uma melhor dissociação, é imprescindível enxaguar as glândulas com PBS. A duração desta etapa, no entanto, deve ser limitada, pois as células apresentam sinais de estresse na PBS; células secundárias dissociadas na PBS rapidamente inchar e morrer.
5. Diluir 20 μL papain [50 U/mL] em 180 μL de enzima de trippsina 1x para obter a solução de dissociação (para escalar para cima ou para baixo manter 9 μL de enzima de trippsina e 1 μL de papain para cada macho). Com fórceps, transfira glândulas acessórias para esta solução.
6. Isole a ponta das glândulas acessórias (contendo células secundárias) da parte proximal. Use fórceps finos para beliscar firmemente o meio de um lobo glandular e cortar com a ponta afiada de um segundo fórceps. Remova a parte proximal das glândulas acessórias e do ducto ejaculatório para melhorar a dissociação e reduzir o tempo de triagem celular.
   NOTA: Dissecar a parte distal de 20 pares de glândulas levará de 15 a 20 minutos e a digestão por peptidases começará assim em temperatura ambiente.
7. Depois de todas as pontas da glândula terem sido dissecadas, transfira-as para um tubo de 1,5 mL usando uma ponta especial de tubulação de 200 μL preparada no Passo 1.2.1. Deve ser largo, arredondado e molhado antes de manusear glândulas.
   NOTA: Para insutar tecido da glândula acessório, as pontas devem ser sempre pré-molhadas com solução apropriada (enzima trypsin ou SSM, mantenha um tubo de cada para este fim). Enxágue cuidadosamente as pontas entre as amostras para evitar contaminação.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Binocular microscope for dissection
Binocular with light source for GFP
Bunsen
Plastic microtubes 1.5 mL	Eppendorf
Fine dissection forceps
Foetal bovine serum	Gibco	10270-106	heat inactivated prior to use
Glass dishes for dissection
Ice bucket
P1000	Gilson
P20	Gilson
P200	Gilson
Papain			50U/mL stock
PBS			home made
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15070-063
Schneider’s Drosophila medium	Gibco	21720-001
Tipone 1250 μL graduated tip	Starlab	S1161-1820
Tipone 200 μL bevelled tip	Starlab	S1161-1800
TrypLE Express Enzyme	Gibco	12604013