Overview
此视频描述了从雄性苍蝇的附属腺体的解剖,并显示了一个例子,其中分离的腺体将被分离成一个单一的细胞悬架。
Protocol
本协议摘自 Immarigeon等人,一个基于 FACS 的协议,将RNA从 德罗索菲拉 男性配件腺的二级细胞分离,J. Vis. Exp. (2019)。
1. 解决方案和材料准备
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准备以下解决方案。
- 准备血清补充介质(SSM):施耐德的 嗜血杆菌 介质补充10%热灭活胎儿牛血清和1%青霉素-链霉素。
- 准备1x三氯辛酶(如TrypLE速递酶)的别名,并在室温下储存。
- 准备木瓜 [50 U/mL] 的别名(储存在 -20 °C,仅解冻一次)。
- 准备1x磷酸盐缓冲盐水(PBS,储存在室温下)。
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为附属腺体的物理分离准备多个火焰圆管提示。
注: 使用低保留提示处理配件腺体,因为它们倾向于坚持未经处理的塑料。火焰四舍五入的过程减少了尖端开口,并平滑了尖端的边缘。这确保了多肽酶消化后的有效分离,而不会剪切细胞膜。- 用锋利的刀片切开一个 200 μL 尖端,轻轻将其传递到火焰上,使其尖端四舍五入,使开口更宽,但在步骤 2.7 期间处理光滑。
- 通过在火焰附近传递尖端开口不到一秒钟,缩小多个 1,000 μL 提示的开口。稍微旋转尖端以避免过度熔化或堵塞。对从窄到宽的提示进行排序。这可以通过定时渴望的速度来完成。尝试分离小规模的 AGs 样本,以测试最窄提示的效率。
注: 这些提示对于机械搅拌至关重要。优质的火焰圆管尖端允许完全分离,同时保持细胞的生存能力。因此,这些提示在重复使用程序结束时用水彻底清洗。这允许每天重复分离。
2. 解剖配件腺体
- 将20至25名男性 德罗索菲拉 放入冰上的玻璃盘中。
- 在SSM中解剖1名男性。取出生殖道,从射精管外的所有其他组织中清除附属腺对。
注: 去除睾丸,因为释放的精子可以产生团块并扰乱分离过程。取出射精灯泡,使漂浮时的处理变得困难。 - 使用钳子,在室温下将附属腺体转移到充满 SSM 的玻璃板中。重复步骤 2.2-2.3 20 次,以获得一批 20 对腺体在 SSM 中。
注: 这些步骤将在 15 到 20 分钟内完成。 AGs 应该看起来健康, 腺体周围肌肉层的腹肌运动应该可见。使用荧光显微镜可监测GFP。 - 在室温下将附属腺体转移到 1 倍 PBS,洗涤 1-2 分钟。
注: 为了更好地分离,必须用 PBS 冲洗腺体。但是,由于细胞在PBS中显示出压力迹象,这一步骤的持续时间应受到限制:PBS中分离的二级细胞迅速膨胀和死亡。 - 将 20 μL Papain [50 U/mL] 稀释到 180 μL 的 1x trypsin 酶中,以获得分离溶液(向上或向下扩展,为每位男性保留 9 μL 的 trypsin 酶和 1 μL 的木瓜因)。使用钳子,将附属腺体转移到此解决方案中。
- 将附属腺(包含二级细胞)的尖端从近部分离。使用细钳牢牢地捏住腺叶的中间,并用第二个钳子的尖端切开。去除附属腺体和射精管的近部,以改善分离和减少细胞分拣时间。
注: 从20对腺体解剖解剖部分需要15至20分钟,因此多肽消化将在室温下开始。 - 在解剖完所有腺体提示后,使用在步骤 1.2.1 中准备的特殊 200 μL 管道尖端将它们转移到 1.5 mL 管中。在处理腺体之前,它应该是宽的、圆润的和潮湿的。
注: 要吹管附属腺组织,提示应始终预先湿与适当的溶液(trypsin酶或SSM,保持每个管为此目的)。小心地冲洗样品之间的提示,以避免污染。
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Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Binocular microscope for dissection | |||
Binocular with light source for GFP | |||
Bunsen | |||
Plastic microtubes 1.5 mL | Eppendorf | ||
Fine dissection forceps | |||
Foetal bovine serum | Gibco | 10270-106 | heat inactivated prior to use |
Glass dishes for dissection | |||
Ice bucket | |||
P1000 | Gilson | ||
P20 | Gilson | ||
P200 | Gilson | ||
Papain | 50U/mL stock | ||
PBS | home made | ||
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15070-063 | |
Schneider’s Drosophila medium | Gibco | 21720-001 | |
Tipone 1250 μL graduated tip | Starlab | S1161-1820 | |
Tipone 200 μL bevelled tip | Starlab | S1161-1800 | |
TrypLE Express Enzyme | Gibco | 12604013 |