Drosophila Männliche Zubehör Drüsensektion: Eine Methode, um sekundäre Zellen zu isolieren

Overview

Dieses Video beschreibt die Zerlegung der Zubehördrüsen von männlichen Fliegen und zeigt ein Beispiel, in dem die isolierte Drüse in eine einzellige Suspension zerlegt wird.

Protocol

Dieses Protokoll ist ein Auszug aus Immarigeon et al.,A FACS-based Protocol to Isolate RNA from the Secondary Cells of Drosophila Male Accessory Dlands, J. Vis. Exp. (2019).

1. Lösungen und Materialvorbereitung

1. Bereiten Sie die folgenden Lösungen vor.
   1. Serum Supplemented Medium (SSM): Schneiders Drosophila Medium ergänzt durch 10% hitzeinaktiviertes fetales Rinderserum und 1% Penicillin-Streptomycin.
   2. Aliquots des 1x Trypsin-Enzyms (z. B. TrypLE Express-Enzym) vorbereiten und bei Raumtemperatur lagern.
   3. Bereiten Sie Aliquots von Papain [50 U/ml] vor (bei -20 °C gespeichert und nur einmal aufgetaut).
   4. 1x Phosphatpuffer-Saline (PBS, bei Raumtemperatur gelagert) vorbereiten.
2. Bereiten Sie mehrere flammenabgerundete Pipettenspitzen für die physikalische Dissoziation von Zubehördrüsen vor.
   HINWEIS: Verwenden Sie niedrige Retentionsspitzen für den Umgang mit Zubehördrüsen, da sie dazu neigen, an unbehandeltem Kunststoff zu haften. Der Prozess der Flammenrundung reduziert die Spitzenöffnung und glättet die Ränder der Spitze. Dies gewährleistet eine effiziente Dissoziation nach der Peptidase-Verdauung, ohne die Zellmembranen zu scheren.
   1. Schneiden Sie eine 200-L-Spitze mit einer scharfen Klinge und geben Sie sie vorsichtig über eine Flamme, um ihre Spitze abzurunden, so dass die Öffnung breiter, aber glatt für die Handhabung während Schritt 2.7 ist.
   2. Verengen Sie die Öffnung mehrerer 1.000 L-Spitzen, indem Sie die Spitzenöffnung in der Nähe einer Flamme für weniger als eine Sekunde passieren. Drehen Sie die Spitze leicht, um Überschmelzen oder Verstopfen zu vermeiden. Sortieren Sie die Tipps von schmaler nach breiter. Dies kann durch Timing der Geschwindigkeit der Aspiration getan werden. Versuchen Sie, eine kleine Maßstabsprobe von AGs zu trennen, um die Effizienz der engsten Spitzen zu testen.
      HINWEIS: Diese Tipps sind entscheidend für die mechanische Rührung. Hochwertige flammenabgerundete Pipettenspitzen ermöglichen eine vollständige Dissoziation bei gleichzeitiger Erhaltung der Zelllebensfähigkeit. Als solche werden diese Spitzen am Ende des Wiederverwendungsverfahrens gründlich mit Wasser gewaschen. Dies ermöglicht eine tägliche reproduzierbare Dissoziation.

2. Dissektion der Accessory Drüsen

1. 20 bis 25 männliche Drosophila in eine Glasschale auf Eis legen.
2. Sezieren Sie 1 Männchen in SSM. Nehmen Sie seinen Fortpflanzungstrakt ab und löschen Sie das Zubehör Drüsenpaar von allen anderen Geweben außer dem Ejakulationskanal.
   HINWEIS: Entfernen Sie Hoden, weil die freigesetzten Spermien Klumpen erzeugen und den Dissoziationsprozess stören können. Entfernen Sie die Ejakulationslampe, die die Handhabung schwierig macht, wenn sie schwimmt.
3. Mit Zangen Zubehördrüsen auf eine mit SSM gefüllte Glasplatte bei Raumtemperatur übertragen. Wiederholen Sie die Schritte 2.2-2.3 20 mal, um eine Charge von 20 Drüsenpaaren in SSM zu erhalten.
   HINWEIS: Diese Schritte werden in 15 bis 20 min erreicht. AGs sollten gesund aussehen, und die peristaltischen Bewegungen der Muskelschicht um Drüsen sollten sichtbar sein. GFP kann mit einem Fluoreszenzmikroskop überwacht werden.
4. Zubehördrüsen auf 1x PBS für eine 1-2 min Waschen bei Raumtemperatur übertragen.
   HINWEIS: Für eine bessere Dissoziation ist es unerlässlich, die Drüsen mit PBS zu spülen. Die Dauer dieses Schritts sollte jedoch begrenzt sein, da die Zellen Anzeichen von Stress in PBS aufweisen; dissoziierte Sekundärzellen in PBS schwellen schnell an und sterben ab.
5. Verdünnen Sie 20 l Papain [50 U/ml] in 180 l 1x Trypsin-Enzym, um die Dissoziationslösung zu erhalten (um die Dissoziationslösung zu skalieren oder zu halten, halten Sie 9 l Trypsin-Enzym und 1 l Papain für jedes Männchen). Mit Zangen, übertragen Zubehördrüsen auf diese Lösung.
6. Isolieren Sie die Spitze der Zubehördrüsen (die Sekundärzellen enthalten) vom proximalen Teil. Verwenden Sie feine Zange fest in der Mitte eines Drüsenlappens kneifen und schneiden Sie mit der scharfen Spitze einer zweiten Zange. Entfernen Sie den proximalen Teil der Zubehördrüsen und den Ejakulationskanal, um die Dissoziation zu verbessern und die Zellsortierzeit zu reduzieren.
   HINWEIS: Die Zerlegung des distalen Teils von 20 Drüsenpaaren dauert 15 bis 20 min und die Verdauung durch Peptidasen beginnt somit bei Raumtemperatur.
7. Nachdem alle Drüsenspitzen seziert wurden, übertragen Sie sie in ein 1,5 ml-Rohr mit einer speziellen 200-L-Pipettenspitze, die in Schritt 1.2.1 vorbereitet wurde. Es sollte breit, abgerundet und nass sein, bevor man Drüsen behandelt.
   HINWEIS: Für Pipetten-Zubehör-Drüsengewebe sollten Spitzen immer mit geeigneter Lösung vornass sein (Trypsin-Enzym oder SSM, halten Sie jeweils eine Röhre für diesen Zweck). Spülen Sie die Spitzen zwischen den Proben vorsichtig aus, um eine Kontamination zu vermeiden.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Binocular microscope for dissection
Binocular with light source for GFP
Bunsen
Plastic microtubes 1.5 mL	Eppendorf
Fine dissection forceps
Foetal bovine serum	Gibco	10270-106	heat inactivated prior to use
Glass dishes for dissection
Ice bucket
P1000	Gilson
P20	Gilson
P200	Gilson
Papain			50U/mL stock
PBS			home made
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15070-063
Schneider’s Drosophila medium	Gibco	21720-001
Tipone 1250 μL graduated tip	Starlab	S1161-1820
Tipone 200 μL bevelled tip	Starlab	S1161-1800
TrypLE Express Enzyme	Gibco	12604013