Drosofilia Dissezione ghiandola accessoria maschile: un metodo per isolare le cellule secondarie

Overview

Questo video descrive la dissezione delle ghiandole accessorie dalle mosche maschili e mostra un esempio in cui la ghiandola isolata verrà dissociata in una singola sospensione cellulare.

Protocol

Questo protocollo è un estratto da Immarigeon et al.,Un protocollo basato su FACS per isolare l'RNA dalle cellule secondarie delle ghiandole accessorie maschili di Drosophila, J. Vis. Exp. (2019).

1. Soluzioni e preparazione dei materiali

1. Preparare le soluzioni seguenti.
   1. Prepare Serum Supplemented Medium (SSM): il mezzo Drosophila di Schneider completato da siero bovino fetale inattivato al calore al 10% e all'1% di penicillina-streptomicina.
   2. Preparare aliquote di 1x enzima tripside (ad esempio, enzima TrypLE Express) e conservare a temperatura ambiente.
   3. Preparare aliquote di papaina [50 U/mL] (conservate a -20 °C e scongelate una sola volta).
   4. Preparare 1x tampone fosfato salina (PBS, conservato a temperatura ambiente).
2. Preparare più punte di pipetta arrotondate alla fiamma per la dissociazione fisica delle ghiandole accessorie.
   NOTA: Utilizzare punte a bassa ritenzione per la gestione delle ghiandole accessorie in quanto tendono ad aderire alla plastica non trattata. Il processo di arrotondamento della fiamma riduce l'apertura della punta e leviga i bordi della punta. Ciò garantisce un'efficace dissociazione dopo la digestione della peptidasi senza tosare le membrane cellulari.
   1. Tagliare una punta da 200 μL con una lama affilata e passarla delicatamente su una fiamma per arrotondare la punta in modo che l'apertura sia più ampia ma liscia per la manipolazione durante il passaggio 2.7.
   2. Restringere l'apertura di più punte da 1.000 μL passando l'apertura della punta vicino a una fiamma per meno di un secondo. Ruotare leggermente la punta per evitare la fusione o l'intasamento. Ordina le punte fatte da più strette a più larghe. Questo può essere fatto cronometrando la velocità di aspirazione. Cerca di dissociare un campione su piccola scala di AG per testare l'efficienza delle punte più strette.
      NOTA: Queste punte sono fondamentali per l'agitazione meccanica. Le punte di pipetta arrotondate alla fiamma di qualità consentono una dissociazione completa preservando la vitalità cellulare. Pertanto, queste punte vengono lavate accuratamente con acqua alla fine della procedura per il riutilizzo. Ciò consente la dissociazione riproducibile quotidiana.

2. Dissezione delle ghiandole accessorie

1. Metti da 20 a 25 Drosophila maschi in un piatto di vetro sul ghiaccio.
2. Sezionare 1 maschio nell'MVU. Togliti il tratto riproduttivo e cancella la coppia di ghiandole accessorie da tutti gli altri tessuti ad eccezione del condotto eiaculatorio.
   NOTA: Rimuovere i teste perché lo sperma rilasciato può creare grumi e disturbare il processo di dissociazione. Rimuovere la lampadina eiaculatoria, il che rende difficile la manipolazione quando galleggia.
3. Con le forcep, trasferire le ghiandole accessorie su una piastra di vetro riempita con MVU a temperatura ambiente. Ripetere i passaggi 2.2-2.3 20 volte per ottenere un lotto di 20 coppie di ghiandole nell'MVU.
   NOTA: Questi passaggi saranno raggiunti in 15-20 minuti. La GFP può essere monitorata utilizzando un microscopio fluorescente.
4. Trasferire le ghiandole accessorie a 1x PBS per un lavaggio di 1-2 minuti a temperatura ambiente.
   NOTA: Per una migliore dissociazione, è imperativo sciacquare le ghiandole con PBS. La durata di questo passaggio, tuttavia, dovrebbe essere limitata in quanto le cellule mostrano segni di stress nel PBS; cellule secondarie dissociate in PBS si gonfiano rapidamente e muoiono.
5. Diluire 20 μL di papaina [50 U/mL] in 180 μL di 1x enzima tripside per ottenere la soluzione di dissociazione (per scalare verso l'alto o verso il basso mantenere 9 μL di enzima tripside e 1 μL di papaina per ogni maschio). Con le forcep, trasferire ghiandole accessorie a questa soluzione.
6. Isolare la punta delle ghiandole accessorie (contenenti celle secondarie) dalla parte prossimale. Utilizzare forcep fini per pizzicare saldamente il centro di un lobo ghiandolare e tagliare con la punta affilata di una seconda forza. Rimuovere la parte prossimale delle ghiandole accessorie e il condotto eiaculatorio per migliorare la dissociazione e ridurre i tempi di smistamento cellulare.
   NOTA: Sezionando la parte distale da 20 paia di ghiandole ci saranno da 15 a 20 minuti e la digestione mediante peptidasi inizierà quindi a temperatura ambiente.
7. Dopo che tutte le punte della ghiandola sono state sezionate, trasferirle in un tubo da 1,5 ml utilizzando una speciale punta del tubo da 200 μL preparata al passaggio 1.2.1. Dovrebbe essere largo, arrotondato e bagnato prima di maneggiare le ghiandole.
   NOTA: Per pipet tessuto ghiandolare accessorio, le punte devono sempre essere pre-bagnate con una soluzione appropriata (enzima tripside o MVU, tenere un tubo di ciascuno per questo scopo). Risciacquare accuratamente le punte tra i campioni per evitare la contaminazione.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Binocular microscope for dissection
Binocular with light source for GFP
Bunsen
Plastic microtubes 1.5 mL	Eppendorf
Fine dissection forceps
Foetal bovine serum	Gibco	10270-106	heat inactivated prior to use
Glass dishes for dissection
Ice bucket
P1000	Gilson
P20	Gilson
P200	Gilson
Papain			50U/mL stock
PBS			home made
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15070-063
Schneider’s Drosophila medium	Gibco	21720-001
Tipone 1250 μL graduated tip	Starlab	S1161-1820
Tipone 200 μL bevelled tip	Starlab	S1161-1800
TrypLE Express Enzyme	Gibco	12604013