드로소필라 남성 액세서리 선착장 해부: 보조 세포를 분리하는 방법

Overview

이 비디오는 수컷 파리의 부속을 설명하고 격리된 선이 단일 세포 현탁액으로 해리되는 예를 보여줍니다.

Protocol

이 프로토콜은 Immarigeon 외에서발췌입니다 ., 드로소필라 남성 액세서리 땀샘의 이차 세포에서 RNA를 격리하는 FACS 기반 프로토콜, J. Vis. Exp. (2019).

1. 솔루션 및 재료 준비

1. 다음 솔루션을 준비합니다.
   1. 세럼 보충 매체 (SSM): 슈나이더의 Drosophila 매체는 10 % 열 불활성 태아 소 혈청과 1 % 페니실린 - 연쇄 절제술로 보완.
   2. 1배 트립신 효소(예: 트립플 익스프레스 효소)의 알리쿼트(aliquots)를 준비하고 실온에서 보관하십시오.
   3. 파파인 【50 U/mL】의 알리쿼트(-20°C에 저장하고 한 번만 해동)의 알리쿼트를 준비한다.
   4. 1x 인산염 완충식염식염수(PBS, 실온에 보관)를 준비한다.
2. 액세서리 땀샘의 물리적 해리를 위해 여러 개의 화염 둥근 파이프 팁을 준비합니다.
   참고: 처리되지 않은 플라스틱을 부착하는 경향이 있는 액세서리 땀샘을 처리하기 위해 낮은 보존 팁을 사용합니다. 화염 반올림 프로세스는 팁 개구부를 줄이고 팁가장자리를 부드럽게 합니다. 이것은 세포막을 깎지 않고 펩티다아제 소화 후에 능률적인 해리를 보장합니다.
   1. 날카로운 블레이드로 200 μL 팁 하나를 자르고 부드럽게 화염 위에 전달하여 2.7 단계에서 개구부가 넓지만 매끄럽게 처리되도록 팁을 둥글게 합니다.
   2. 1초 이내에 불꽃 근처에서 팁 개구부를 통과하여 여러 1,000 μL 팁의 개구부를 좁히십시오. 팁이 과도하게 녹거나 막히는 것을 방지하기 위해 팁을 약간 회전합니다. 더 좁은 팁에서 더 넓은 팁으로 정렬합니다. 이것은 포부의 속도를 타이밍에 의해 수행 할 수 있습니다. 가장 좁은 팁의 효율성을 테스트하기 위해 작은 규모의 AG 샘플을 분리해 보십시오.
      참고: 이러한 팁은 기계적 동요에 매우 중요합니다. 품질 화염 둥근 파이프 팁은 세포 생존가능성을 유지하면서 완전한 해리를 가능하게 합니다. 따라서, 이러한 팁은 재사용 절차의 끝에 물로 철저히 세척된다. 이를 통해 매일 재현가능한 해리를 할 수 있습니다.

2. 액세서리 땀샘의 해부

1. 20~25명의 남성 드로소필라를 유리 접시에 넣고 얼음 위에 놓습니다.
2. SSM에서 남성 1을 해부하십시오. 생식 기관을 벗고 사정 덕트 외에도 다른 모든 조직에서 액세서리 선질을 제거하십시오.
   참고: 방출된 정액이 덩어리를 만들고 해리 과정을 방해할 수 있기 때문에 고환을 제거하십시오. 사정 전구를 제거하여 수레에 수레를 띄울 때 취급이 어려워집니다.
3. 집게로 액세서리 땀샘을 실온에서 SSM으로 채워진 유리 판으로 옮긴다. SSM에서 20쌍의 땀샘을 얻으려면 2.2-2.3 20번 단계를 반복합니다.
   참고: 이 단계는 15 에서 20 분에서 달성 될 것입니다. GFP는 형광 현미경을 사용하여 모니터링할 수 있다.
4. 실온에서 1-2분 세척을 위해 액세서리 땀샘을 1x PBS로 옮긴다.
   참고: 더 나은 해리를 위해, PBS와 땀샘을 헹구는 것이 필수적입니다. 그러나 이 단계의 지속 시간은 세포가 PBS에서 스트레스의 징후를 보이기 때문에 제한되어야합니다. PBS에서 해리된 이차 세포는 급속하게 팽창하고 죽습니다.
5. 20 μL 파파인 [50 U/mL]을 1x 트립신 효소의 180 μL로 희석하여 해리 용액을 얻습니다(트립신 효소 9μL 및 각 남성에 대한 1 μL을 유지). 집게를 사용하면 액세서리 땀샘을 이 솔루션으로 이송합니다.
6. 부속땀샘의 끝을 근위 부에서 분리한다(이차 세포 포함). 미세 한 집게를 사용하여 선 엽의 중간을 단단히 꼬집어 두 번째 집게의 날카로운 끝으로 자른다. 소속땀샘의 근접 부분을 제거하고 사정 덕트를 제거하여 해리를 개선하고 세포 정렬 시간을 줄입니다.
   참고: 땀샘 20쌍에서 해부하는 것은 15-20분 정도 걸리며, 펩티다제에 의한 소화는 실온에서 시작됩니다.
7. 모든 선 팁이 해부된 후 1.2.1 단계에서 준비된 특수 200 μL 파이프 팁을 사용하여 1.5mL 튜브로 전송합니다. 땀샘을 처리하기 전에 넓고 둥글고 젖어야합니다.
   참고: 액세서리 선조직을 피펫하려면 팁은 항상 적절한 용액(트립신 효소 또는 SSM)으로 미리 습해야 하며, 이 목적을 위해 각 튜브를 하나씩 보관해야 합니다. 오염을 피하기 위해 샘플 간에 팁을 조심스럽게 헹신다.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Binocular microscope for dissection
Binocular with light source for GFP
Bunsen
Plastic microtubes 1.5 mL	Eppendorf
Fine dissection forceps
Foetal bovine serum	Gibco	10270-106	heat inactivated prior to use
Glass dishes for dissection
Ice bucket
P1000	Gilson
P20	Gilson
P200	Gilson
Papain			50U/mL stock
PBS			home made
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15070-063
Schneider’s Drosophila medium	Gibco	21720-001
Tipone 1250 μL graduated tip	Starlab	S1161-1820
Tipone 200 μL bevelled tip	Starlab	S1161-1800
TrypLE Express Enzyme	Gibco	12604013