Drosophila Disección de glándulas accesorios masculinas: un método para aislar las células secundarias

Overview

Este video describe la disección de las glándulas accesorias de las moscas masculinas y muestra un ejemplo en el que la glándula aislada se disociará en una sola suspensión celular.

Protocol

Este protocolo es un extracto de Immarigeon et al., Un protocolo basado en FACS para aislar el ARN de las células secundarias de las glándulas accesorios masculinas de Drosophila, J. Vis. Exp. (2019).

1. Soluciones y preparación de materiales

1. Prepare las siguientes soluciones.
   1. Preparar medio suero suplementado (MUS): Medio de Drosophila de Schneider complementado con 10% suero bovino fetal inactivado por calor y 1% penicilina-estreptomicina.
   2. Preparar alícuotas de 1x enzima trypsina (por ejemplo, enzima TrypLE Express) y almacenar a temperatura ambiente.
   3. Preparar alícuotas de papaína [50 U/mL] (almacenada a -20 °C y descongelada sólo una vez).
   4. Preparar solución salina de búfer de fosfato 1x (PBS, almacenado a temperatura ambiente).
2. Prepare múltiples puntas de pipeta redondeadas por llama para la disociación física de las glándulas accesorias.
   NOTA: Utilice puntas de baja retención para manipular las glándulas accesorios, ya que tienden a adherirse al plástico no tratado. El proceso de redondeo de llama reduce la abertura de la punta y suaviza los bordes de la punta. Esto asegura una disociación eficiente después de la digestión peptídica sin esquimar las membranas celulares.
   1. Corte una punta de 200 μL con una hoja afilada y páselo suavemente sobre una llama para redondear su punta para que la abertura sea más ancha pero suave para su manejo durante el paso 2.7.
   2. Reduzca la abertura de múltiples puntas de 1.000 μL pasando la abertura de la punta cerca de una llama durante menos de un segundo. Gire ligeramente la punta para evitar el derretimiento excesivo o la obstrucción. Ordene las puntas hechas de más estrechas a más anchas. Esto se puede hacer cronometrando la velocidad de la aspiración. Trate de disociar una muestra a pequeña escala de AGs para probar la eficiencia de los consejos más estrechos.
      NOTA: Estos consejos son críticos para la agitación mecánica. Las puntas de pipete redondeadas por llama de calidad permiten una disociación completa y preservan la viabilidad celular. Como tal, estos consejos se lavan a fondo con agua al final del procedimiento para su reutilización. Esto permite la disociación reproducible del día a día.

2. Disección de glándulas accesorios

1. Ponga de 20 a 25 drosophila macho en un plato de vidrio sobre hielo.
2. Diseccionar 1 macho en SSM. Despega su aparato reproductor y limpia el par de glándulas accesorios de todos los demás tejidos aparte del conducto eyaculatorio.
   NOTA: Retire los testículos porque los espermatozoides liberados pueden crear grupos y perturbar el proceso de disociación. Retire la bombilla eyaculatoria, lo que dificulta el manejo cuando flota.
3. Con fórceps, transfiera las glándulas accesorios a una placa de vidrio llena de MUS a temperatura ambiente. Repita los pasos 2.2-2.3 20 veces para obtener un lote de 20 pares de glándulas en SSM.
   NOTA: Estos pasos se lograrán en 15 a 20 min. Los AGs deben verse saludables, y los movimientos peristálticos de la capa muscular alrededor de las glándulas deben ser visibles. La GFP se puede controlar mediante un microscopio fluorescente.
4. Transfiera las glándulas accesorias a 1x PBS para un lavado de 1-2 minutos a temperatura ambiente.
   NOTA: Para una mejor disociación, es imperativo enjuagar las glándulas con PBS. La duración de este paso, sin embargo, debe limitarse ya que las células muestran signos de estrés en PBS; células secundarias disociadas en PBS se hinchan rápidamente y mueren.
5. Diluir 20 μL de papaína [50 U/ml] en 180 μL de enzima 1x trippsina para obtener la solución de disociación (para escalar hacia arriba o hacia abajo mantener 9 μL de enzima trypsina y 1 μL de papaína para cada macho). Con fórceps, transfiera las glándulas accesorios a esta solución.
6. Aísle la punta de las glándulas accesorias (que contienen células secundarias) de la parte proximal. Utilice fórceps finos para pellizcar firmemente el medio de un lóbulo glandular y cortar con la punta afilada de una segunda fórceps. Retire la parte proximal de las glándulas accesorias y el conducto eyaculatorio para mejorar la disociación y reducir el tiempo de clasificación celular.
   NOTA: Diseccionar la parte distal de 20 pares de glándulas tomará de 15 a 20 minutos y la digestión por péptidos comenzará así a temperatura ambiente.
7. Después de que todas las puntas de la glándula hayan sido diseccionadas, transfiéralas a un tubo de 1,5 ml utilizando una punta especial de pipete de 200 μL preparada en el paso 1.2.1. Debe ser ancho, redondeado y húmedo antes de manipular las glándulas.
   NOTA: Para pipetear el tejido de la glándula accesorio, las puntas siempre deben estar pre-húmedas con la solución adecuada (enzima trypsin o MUS, mantener un tubo de cada uno para este propósito). Enjuague cuidadosamente las puntas entre muestras para evitar la contaminación.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Binocular microscope for dissection
Binocular with light source for GFP
Bunsen
Plastic microtubes 1.5 mL	Eppendorf
Fine dissection forceps
Foetal bovine serum	Gibco	10270-106	heat inactivated prior to use
Glass dishes for dissection
Ice bucket
P1000	Gilson
P20	Gilson
P200	Gilson
Papain			50U/mL stock
PBS			home made
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15070-063
Schneider’s Drosophila medium	Gibco	21720-001
Tipone 1250 μL graduated tip	Starlab	S1161-1820
Tipone 200 μL bevelled tip	Starlab	S1161-1800
TrypLE Express Enzyme	Gibco	12604013