Drosophila Mannlig tilbehør kjertel disseksjon: En metode for å isolere sekundære celler

Overview

Denne videoen beskriver disseksjonen av tilbehørskjertlene fra mannlige fluer og viser et eksempel der den isolerte kjertelen vil bli dissosiert til en enkelt celle suspensjon.

Protocol

Denne protokollen er et utdrag fra Immarigeon et al.,en FACS-basert protokoll for å isolere RNA fra sekundærcellene til Drosophila Male Accessory Glands, J. Vis. Exp. (2019).

1. Løsninger og materialforberedelse

1. Forbered følgende løsninger.
   1. Forbered serum supplert medium (SSM): Schneiders Drosophila medium supplert med 10% varme inaktivert foster bovint serum og 1% Penicillin-Streptomycin.
   2. Forbered aliquots av 1x trypsin enzym (f.eks. TrypLE Express Enzyme) og oppbevar ved romtemperatur.
   3. Forbered aliquots av papain [50 U / ml] (lagret ved -20 °C og tin bare en gang).
   4. Forbered 1x fosfatbuffer saltvann (PBS, lagret ved romtemperatur).
2. Forbered flere flammeavrundede pipetspisser for fysisk dissosiasjon av tilbehørskjertler.
   MERK: Bruk lave oppbevaringstips for håndtering av tilbehørskjertler, da de har en tendens til å holde seg til ubehandlet plast. Prosessen med flammeavrunding reduserer spissåpningen og glatter ut kantene på spissen. Dette sikrer en effektiv dissosiasjon etter peptidase fordøyelsen uten å skjære cellemembranene.
   1. Klipp en 200 μL spiss med et skarpt blad og før den forsiktig over en flamme for å runde av spissen slik at åpningen er bredere, men glatt for håndtering i trinn 2.7.
   2. Smal åpningen av flere 1000 μL spisser ved å passere spissåpningen nær en flamme i mindre enn ett sekund. Roter spissen litt for å unngå oversmelting eller tilstopping. Sorter tipsene fra smalere til bredere. Dette kan gjøres ved å tidsmessig tidsberegning hastigheten på aspirasjon. Prøv å ta avstand fra et lite utvalg av AG-er for å teste effektiviteten til de smaleste tipsene.
      MERK: Disse tipsene er kritiske for mekanisk agitasjon. Avrundede pipetspisser av høy kvalitet gir fullstendig dissosiasjon samtidig som celle levedyktigheten bevares. Som sådan vaskes disse tipsene grundig med vann på slutten av prosedyren for gjenbruk. Dette gir mulighet for daglig reproduserbar dissosiasjon.

2. Disseksjon av tilbehørskjertler

1. Legg 20 til 25 mannlige Drosophila i en glassfat på is.
2. Disseker 1 mann i SSM. Ta av reproduksjonskanalen og fjern tilbehørskjertelparet fra alle andre vev bortsett fra ejakasjonskanalen.
   MERK: Fjern testikler fordi den frigjorte sæden kan lage klumper og forstyrre dissosiasjonsprosessen. Fjern ejakulasjonspæren, noe som gjør håndtering vanskelig når den flyter.
3. Med tang, overfør tilbehørskjertler til en glassplate fylt med SSM ved romtemperatur. Gjenta trinn 2.2-2.3 20 ganger for å få en batch på 20 par kjertler i SSM.
   MERK: Disse trinnene vil bli oppnådd i 15 til 20 min. AG bør se sunn ut, og de peristaltiske bevegelsene i muskellaget rundt kjertler skal være synlige. GFP kan overvåkes ved hjelp av et fluorescerende mikroskop.
4. Overfør tilbehørskjertler til 1x PBS for en 1-2 min vask ved romtemperatur.
   MERK: For bedre dissosiasjon er det viktig å skylle kjertlene med PBS. Varigheten av dette trinnet bør imidlertid begrenses da cellene viser tegn på stress i PBS; dissosierte sekundære celler i PBS svulmer raskt og dør.
5. Fortynn 20 μL papain [50 U/ml] i 180 μL 1x trypsinenzym for å oppnå dissosiasjonsløsningen (for å skalere opp eller ned holde 9 μL trypsinenzym og 1 μL papain for hver mann). Med tang, overfør tilbehørskjertler til denne løsningen.
6. Isoler spissen av tilbehørskjertler (som inneholder sekundære celler) fra den proksimale delen. Bruk fine tang for å klemme fast midten av en kjertel lobe og kutt med den skarpe spissen av en andre tang. Fjern den proksimale delen av tilbehørskjertlene og ejakasjonskanalen for å forbedre dissosiasjon og redusere cellesorteringstiden.
   MERK: Dissekering av den distale delen fra 20 par kjertler vil ta 15 til 20 minutter, og fordøyelsen ved peptidaser vil dermed starte ved romtemperatur.
7. Etter at alle kjertelspissene er dissekert, kan du overføre dem til et 1,5 ml rør ved hjelp av en spesiell 200 μL pipetspiss tilberedt på trinn 1.2.1. Den skal være bred, avrundet og våt før håndtering av kjertler.
   MERK: For å pipet tilbehørskjertelvev, bør spissene alltid være for våte med passende løsning (trypsin enzym eller SSM, hold ett rør av hver for dette formålet). Skyll forsiktig tips mellom prøver for å unngå forurensning.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Binocular microscope for dissection
Binocular with light source for GFP
Bunsen
Plastic microtubes 1.5 mL	Eppendorf
Fine dissection forceps
Foetal bovine serum	Gibco	10270-106	heat inactivated prior to use
Glass dishes for dissection
Ice bucket
P1000	Gilson
P20	Gilson
P200	Gilson
Papain			50U/mL stock
PBS			home made
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15070-063
Schneider’s Drosophila medium	Gibco	21720-001
Tipone 1250 μL graduated tip	Starlab	S1161-1820
Tipone 200 μL bevelled tip	Starlab	S1161-1800
TrypLE Express Enzyme	Gibco	12604013