Melanogaster van Drosophila Eierstokdissectie: een techniek voor ex vivo weefselpreparaat

Overview

Deze video beschrijft de algemene anatomie van de Drosophila-eierstok en bevat een methode om eierstokken te ontleden voor levende of vaste beeldvorming.

Protocol

Dit protocol is een fragment uit Parker et al., Studying Mitochondrial Structure and Function in Drosophila Ovaries, J. Vis. Exp. (2017).

1. Bereiding van Drosophila (de benodigde hulpmiddelen zijn afgebeeld in figuur 1A)

1. Verzamel voor een van de beschreven experimenten drosophila (bij kamertemperatuur of 25 °C) binnen 5 dagen na eclosie en plaats ze in een flacon gevuld met 5 - 7 ml Drosophila-voedsel (zie tabel met materialen),met niet meer dan 25 vliegen in elke flacon; handhaven van een vrouw: mannelijke verhouding van 2:1.
2. Strooi een kleine hoeveelheid gegranuleerde gist om de productie van Drosophila-eieren te stimuleren. Voer experimentele manipulatie uit binnen 2 - 4 dagen.

2. Dissectie van Drosophila-eierstokken (de benodigde hulpmiddelen zijn afgebeeld in figuur 1A)

1. Warm insectendissectiemedium (zie materiaaltabel)tot kamertemperatuur, 25 °C. Vul drie putten van een glazen ontledingsschaal met acht putten, met 200 μL medium in elke put.
2. Verdoof Drosophila met CO₂ door de naald van het blaaspistool onder de flaconplug te plaatsen. Leg ze op een vliegkussen. Sorteer met behulp van een ontleedmicroscoop 5 vrouwtjes en plaats ze in de eerste put van de ontleedschaal. Behandel één Drosophila tegelijk bij het uitvoeren van live microscopie.
3. Terwijl u door het oculair van de dissectiemicroscoop kijkt, snijdt u de thorax van de buik met behulp van twee paar tangen. Breng met behulp van de tang de buiken voorzichtig over naar de tweede put van het gerecht.
4. Gebruik een tang om de buik aan het achterste uiteinde vast te houden en duw de eierstokken langzaam naar buiten (samen met de andere buikinhoud) met het andere paar tangen. Als deze poging mislukt, verwijder dan voorzichtig het abdominale exoskelet door de tang in het voorste uiteinde te steken om de eierstokken vrij te maken.
5. Houd met behulp van de tang een individuele eierstok aan het ondoorzichtige achterste uiteinde(d.w.z.de met dooier gevulde eieren in een laat stadium) vast en verplaats deze voorzichtig naar de derde put van het gerecht om het te plagen om het te verwerken voor live microscopie of voor bevestiging om immunostaining uit te voeren.
6. Plaag de beschermende schede voorzichtig van rond de eierstokken door een plagende naald lichtjes van de posterieure naar het voorste uiteinde van elke eierstok te vegen terwijl je deze bij het achterste uiteinde vasthoudt met een tang.
   OPMERKING: Om schade tijdens het plagen te minimaliseren, buigt u de naaldpunt en zoomt u in op elke eierstok door de vergroting van de microscoop te vergroten (figuur 1A). Plagen moet effectief genoeg zijn om de schede te breken, maar het moet ook zorgvuldig worden gedaan om de integriteit van de ovarioles te behouden.

Representative Results

Figuur 1: Experimenteel plan en voorbereiding. A) Hulpmiddelen die worden gebruikt bij de beschreven methoden: A. Vliegflacon; B. Insectenontledingsmedium; C. Paraformaldehyde; D. Vliegborstel; E. Ontledende schotel; F. Afdekglas; G. Microfuge buis. H. Schotel met glazen bodem; I. Glazen glijbaan; J. 1.000-μL micropipet; K. micropipet van 200 μL; L. 2,5-μL micropipet; M. Het plagen van naald met een gebogen punt (de punt wordt vergroot); N. Dikke tang; O. Dunne tang. (B) Een stroomschema dat de beschreven methoden weergeeft. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Grace's Media (Insect Dissecting Medium)	Fisher Scientific	30611031-2
41 Paraformaldehyde AQ	Electronic Microscopy Sciences	50-259-99
PolyLysine	MP Biomedicals	ICN15017625
Fly Vials	Fisher Scientific	AS-515
Fly Vial Plugs	Fisher Scientific	AS273
Jazzmix Drosophila food (Drosophila food)	Fisher Scientific	AS153
Azer Scientific EverMark Select Microscope Slides	Fisher Scientific	22-026-252
Microscope Cover Glass	Fisher Scientific	12-542-B
Mat Tek Corp Glass Bottom Mircrowell Dish	Fisher Scientific	P35G-0-14-C
Active Dried Yeast	Fisher Scientific	ICN10140001
Dumont #5 Forceps	Fine Science Technologies	11251-20
Moria Nickel Plated Pin Holder	Fine Science Technologies	26016-12
Minutien Pins	Fine Science Technologies	26002-15
MYFP ( w[*]; P{w[+mC]=sqh-EYFP-Mito}3 )	Bloomington Stock Center	7194
Fly Pad	Fly stuff	59-118
Blowgun	Fly stuff	54-104
Blowgun needle	Flystuff	54-119
Dissecting Microscope	Carl Zeiss	Stemi 2000