Drosophila melanogaster Ovar-Dissektion: Eine Technik zur Ex-Vivo-Gewebevorbereitung

Overview

Dieses Video beschreibt die allgemeine Anatomie des Drosophila-Ovarials und zeigt eine Methode, Eierstöcke für lebende oder feste Bildgebung zu sezieren.

Protocol

Dieses Protokoll ist ein Auszug aus Parker et al.,Studying Mitochondrial Structure and Function in Drosophila Ovaries, J. Vis. Exp. (2017).

1. Vorbereitung von Drosophila (die erforderlichen Werkzeuge sind in Abbildung 1Adargestellt)

1. Für alle beschriebenen Experimente Drosophila (bei Raumtemperatur oder 25 °C) innerhalb von 5 Tagen nach der Vereuntung sammeln und in eine Durchstechflasche mit 5 - 7 ml Drosophila-Lebensmitteln (siehe Materialtabelle)mit nicht mehr als 25 Fliegen in jeder Durchstechflasche legen; ein Verhältnis weiblich:männlich von 2:1 beibehalten.
2. Streuen Sie eine kleine Menge granulierter Hefe, um die Drosophila-Eiproduktion zu stimulieren. Führen Sie experimentelle Manipulation innerhalb von 2 - 4 Tagen durch.

2. Dissektion von Drosophila Ovarien (die erforderlichen Werkzeuge sind in Abbildung 1Adargestellt)

1. Warmes Insektensezierendes Medium (siehe Materialtabelle)auf Raumtemperatur, 25 °C. Füllen Sie drei Brunnen einer Acht-Well-Glas-Sezschale, mit 200 L Medium in jedem Brunnen.
2. Anästhetisieren Sie Drosophila mit CO_2, indem Sie die Nadel der Blaspistole unter den Durchstechflasche. Platzieren Sie sie auf einem Fly Pad. Mit einem Sezieren Mikroskop, sortieren Sie 5 Weibchen und legen Sie sie in den ersten Brunnen der Sezschale. Behandeln Sie eine Drosophila zu einer Zeit, wenn Sie Live-Mikroskopie durchführen.
3. Beim Durchblicken durch das Okular des Seziermikroskops, trennen Sie den Thorax mit zwei Zangenpaaren vom Bauch. Mit der Zange, vorsichtig übertragen Sie den Bauch auf den zweiten Brunnen der Schale.
4. Verwenden Sie ein Paar Zangen, um den Bauch am hinteren Ende zu halten, und schieben Sie langsam die Eierstöcke heraus (zusammen mit den anderen Bauchinhalten) mit dem anderen Paar Zangen. Sollte dieser Versuch fehlschlagen, entfernen Sie vorsichtig das Bauchexoskelett, indem Sie die Zange in das vordere Ende einsetzen, um die Eierstöcke freizusetzen.
5. Mit den Zangen halten Sie einen einzelnen Eierstock am undurchsichtigen hinteren Ende(d.h.die mit Dotter gefüllten, späten Stadiumeier) und bewegen Sie ihn vorsichtig in den dritten Brunnen der Schale, um ihn für die Live-Mikroskopie oder zur Fixierung zur Immunfärbung zu bearbeiten.
6. Necken Sie vorsichtig die Schutzhülle um die Eierstöcke herum, indem Sie eine neckende Nadel leicht vom Hinterteil bis zum vorderen Ende jedes Eierstocks fegen, während Sie sie am hinteren Ende mit einem Paar Zangen halten.
   HINWEIS: Um Schäden beim Hänchen zu minimieren, biegen Sie die Nadelspitze und zoomen Sie auf jeden Eierstock, indem Sie die Vergrößerung des Mikroskops erhöhen (Abbildung 1A). Teasing sollte wirksam genug sein, um den Mantel zu brechen, aber es sollte auch sorgfältig getan werden, um die Integrität der Ovarioles zu bewahren.

Representative Results

Abbildung 1: Versuchsplan und Vorbereitung. (A) Werkzeuge, die in den beschriebenen Methoden verwendet werden: A. Fly Fläschchen; B. Insektensezierendes Medium; C. Paraformaldehyd; D. Fliegenbürste; E. Sezieren Gericht; F. Abdeckung Glas; G. Mikrofugerohr. H. Glasbodenschale; I. Glasrutsche; J. 1.000-L-Mikropipette; K. 200-L Mikropipette; L. 2,5-L-Mikropipette; M. Teasing Nadel mit einer gebogenen Spitze (Spitze wird vergrößert); N. Dicke Zange; O. Dünne Zange. (B) Ein Flussdiagrammschema, das die beschriebenen Methoden darstellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Grace's Media (Insect Dissecting Medium)	Fisher Scientific	30611031-2
41 Paraformaldehyde AQ	Electronic Microscopy Sciences	50-259-99
PolyLysine	MP Biomedicals	ICN15017625
Fly Vials	Fisher Scientific	AS-515
Fly Vial Plugs	Fisher Scientific	AS273
Jazzmix Drosophila food (Drosophila food)	Fisher Scientific	AS153
Azer Scientific EverMark Select Microscope Slides	Fisher Scientific	22-026-252
Microscope Cover Glass	Fisher Scientific	12-542-B
Mat Tek Corp Glass Bottom Mircrowell Dish	Fisher Scientific	P35G-0-14-C
Active Dried Yeast	Fisher Scientific	ICN10140001
Dumont #5 Forceps	Fine Science Technologies	11251-20
Moria Nickel Plated Pin Holder	Fine Science Technologies	26016-12
Minutien Pins	Fine Science Technologies	26002-15
MYFP ( w[*]; P{w[+mC]=sqh-EYFP-Mito}3 )	Bloomington Stock Center	7194
Fly Pad	Fly stuff	59-118
Blowgun	Fly stuff	54-104
Blowgun needle	Flystuff	54-119
Dissecting Microscope	Carl Zeiss	Stemi 2000