Overview
וידאו זה מתאר את האנטומיה הכללית של השחלה Drosophila וכולל שיטה של ניתוח השחלות להדמיה חיה או קבועה.
Protocol
פרוטוקול זה הוא קטע מתוך Parker et al., לימוד מבנה מיטוכונדריאלי ותפקוד בשחלות דרוזופילה, J. Vis. Exp. (2017).
1. הכנת דרוזופילה (הכלים הנדרשים מתוארים באיור 1א')
- עבור כל אחד מהניסויים המתוארים, לאסוף Drosophila (מתוחזק בטמפרטורת החדר, או 25 מעלות צלזיוס) בתוך 5 ימים של eclosion ומניחים אותם בקבוקון מלא 5 - 7 מ"ל של מזון Drosophila (ראה טבלה של חומרים),עם לא יותר מ 25 זבובים בכל בקבוקון; לשמור על יחס נקבה:גברי של 2:1.
- מפזרים כמות קטנה של שמרים מגורענים כדי לעורר את ייצור הביצים של דרוזופילה. בצע מניפולציה ניסיונית בתוך 2 - 4 ימים.
2. ניתוח השחלות של דרוסופילה (הכלים הנדרשים מתוארים באיור 1א')
- חרק חם מנתח מדיום (ראו טבלת חומרים)לטמפרטורת החדר, 25 °C (60 °F). ממלאים שלוש בארות של צלחת ניתוח זכוכית שמונה בארות, עם 200 μL של מדיום בכל באר.
- המרדים Drosophila עם CO2 על ידי הנחת המחט של אקדח מכה מתחת לתקע הבקבוקון. מניחים אותם על משטח זבוב. באמצעות מיקרוסקופ מנתח, למיין 5 נקבות ומניחים אותם בבאר הראשונה של צלחת ניתוח. טפל בדרוסופילה אחת בכל פעם בעת ביצוע מיקרוסקופיה חיה.
- תוך כדי התבוננות דרך העין של מיקרוסקופ הניתוח, לנתק את בית החזה מהבטן באמצעות שני זוגות של מלקחיים. באמצעות מלקחיים, בזהירות להעביר את הבטן לבאר השנייה של המנה.
- השתמש בזוג מלקחיים אחד כדי להחזיק את הבטן בקצה האחורי, ולאט לאט לדחוף את השחלות החוצה (יחד עם תכולת הבטן השנייה) עם זוג מלקחיים אחרים. אם ניסיון זה נכשל, להסיר בזהירות את שלד חיצוני הבטן על ידי החדרת המלקחיים לתוך הקצה הקדמון כדי לשחרר את השחלות.
- באמצעות המלקחיים, להחזיק שחלה בודדת על ידי הקצה האחורי אטום(כלומר,הביצים מלא חלמון, בשלב מאוחר) ולהעביר אותו בזהירות לבאר השלישית של המנה עבור מתגרה לעבד אותו עבור מיקרוסקופיה חיה או לתיקון לבצע immunostaining.
- בזהירות להקניט את נדן מגן מסביב השחלות על ידי גורף מחט מתגרה קלות מן האחורי לקצה האחורי של כל שחלה תוך החזקת אותו על ידי הקצה האחורי עם זוג מלקחיים.
שים לב: כדי למזער את הנזק במהלך ההתגרות, כופפו את קצה המחט והגדילו את גודל השחלה על ידי הגדלת המיקרוסקופ (איור 1A). התגרות צריכה להיות יעילה מספיק כדי לשבור את הנדן, אבל זה צריך להיעשות גם בזהירות כדי לשמור על שלמות ovarioles.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
איור 1: תוכנית ניסיונית והכנה. (א) כלים המשמשים בשיטות המתוארות: א. בקבוקון זבוב; ב. מדיום ניתוח חרקים; ג. פרפורמלדהיד; ד. מברשת זבוב; ה. מנות מנתחות; ו. כיסוי זכוכית; צינור ג'י מיקרופוגה. H. צלחת תחתית זכוכית; I. שקופית זכוכית; J. 1,000-μL מיקרופיפט; מיקרופיפט K. 200-μL; ל. מיקרופיפט 2.5-μL; M. מחט מתגרה עם קצה כפוף (קצה מוגדל); נ. מלקחיים עבים; O. מלקחיים דקים. (ב) סכמטי תרשים זרימה המייצג את השיטות המתוארות. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Grace's Media (Insect Dissecting Medium) | Fisher Scientific | 30611031-2 | |
| 41 Paraformaldehyde AQ | Electronic Microscopy Sciences | 50-259-99 | |
| PolyLysine | MP Biomedicals | ICN15017625 | |
| Fly Vials | Fisher Scientific | AS-515 | |
| Fly Vial Plugs | Fisher Scientific | AS273 | |
| Jazzmix Drosophila food (Drosophila food) | Fisher Scientific | AS153 | |
| Azer Scientific EverMark Select Microscope Slides | Fisher Scientific | 22-026-252 | |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-542-B | |
| Mat Tek Corp Glass Bottom Mircrowell Dish | Fisher Scientific | P35G-0-14-C | |
| Active Dried Yeast | Fisher Scientific | ICN10140001 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Technologies | 11251-20 | |
| Moria Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Technologies | 26016-12 | |
| Minutien Pins | Fine Science Technologies | 26002-15 | |
| MYFP ( w[*]; P{w[+mC]=sqh-EYFP-Mito}3 ) | Bloomington Stock Center | 7194 | |
| Fly Pad | Fly stuff | 59-118 | |
| Blowgun | Fly stuff | 54-104 | |
| Blowgun needle | Flystuff | 54-119 | |
| Dissecting Microscope | Carl Zeiss | Stemi 2000 |
