ड्रोसोफिला मेलानोगैस्टर अंडाशय विच्छेदन: पूर्व वीवो ऊतक तैयारी के लिए एक तकनीक

Overview

यह वीडियो ड्रोसोफिला अंडाशय की सामान्य शरीर रचना का वर्णन करता है और जीवित या निश्चित इमेजिंग के लिए अंडाशय को विच्छेदन करने की एक विधि की सुविधा देता है।

Protocol

यह प्रोटोकॉल पार्कर एट अल(2017) में माइटोकॉन्ड्रियल स्ट्रक्चर एंड फंक्शन का अध्ययन करते हुए पार्कर एट अल (2017) का एक अंश है।

1. ड्रोसोफिला की तैयारी (आवश्यक उपकरण चित्र 1एमें चित्रित किए गए हैं)

1. वर्णित किसी भी प्रयोग के लिए, ड्रोसोफिला (कमरे के तापमान पर बनाए रखा गया, या 25 डिग्री सेल्सियस) को ईक्लोस के 5 दिनों के भीतर इकट्ठा करें और उन्हें ड्रोसोफिला भोजन (सामग्री की तालिकादेखें) से भरी एक शीशी में रखें, जिसमें प्रत्येक शीशी में 25 से अधिक मक्खियां नहीं हैं; एक महिला को बनाए रखें: 2:1 का पुरुष अनुपात।
2. ड्रोसोफिला अंडे के उत्पादन को प्रोत्साहित करने के लिए दानेदार खमीर की एक छोटी राशि छिड़कें। 2 - 4 दिनों के भीतर प्रयोगात्मक हेरफेर करें।

2. ड्रोसोफिला अंडाशय का विच्छेदन (आवश्यक उपकरण चित्र 1एमें चित्रित किए गए हैं)

1. गर्म कीट विच्छेदन माध्यम (सामग्री की तालिकादेखें) कमरे के तापमान के लिए, 25 डिग्री सेल्सियस। प्रत्येक कुएं में मध्यम के २०० μL के साथ, एक आठ अच्छी तरह से कांच विच्छेदन पकवान के तीन कुओं को भरें ।
2. शीशी प्लग के नीचे ब्लो गन की सुई रखकर सीओ₂ के साथ ड्रोसोफिला को एनेस्थेटाइज करें। उन्हें एक फ्लाई पैड पर रखें। एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप का उपयोग करके, 5 महिलाओं को सुलझाएं और उन्हें विच्छेदन पकवान के पहले कुएं में रखें। लाइव माइक्रोस्कोपी का प्रदर्शन करते समय एक समय में एक ड्रोसोफिला को संभालें।
3. विच्छेदन माइक्रोस्कोप के आईपीस के माध्यम से देखते समय, दो जोड़ी संदंश का उपयोग करके पेट से छाती को तोड़ दें। संदंश का उपयोग करके, पेट को सावधानीपूर्वक डिश के दूसरे कुएं में स्थानांतरित करें।
4. पीछे के छोर पर पेट को पकड़ने के लिए एक जोड़ी संदंश का उपयोग करें, और धीरे-धीरे अंडाशय को दूसरी जोड़ी संदंश के साथ (अन्य पेट की सामग्री के साथ) बाहर धकेलें। इस प्रयास को विफल करना चाहिए, ध्यान से अंडाशय को छोड़ने के लिए पूर्वकाल अंत में संदंश डालने के द्वारा पेट एक्सोस्केलेटन को हटा दें।
5. संदंश का उपयोग करके, अपारदर्शी पीछे के छोर(यानी,जर्दी से भरे, देर से चरण के अंडे) द्वारा एक व्यक्तिगत अंडाशय को पकड़ें और इसे लाइव माइक्रोस्कोपी के लिए संसाधित करने के लिए या इम्यूनोस्टेपिंग करने के लिए फिक्सिंग के लिए चिढ़ाने के लिए पकवान के तीसरे कुएं में सावधानी से ले जाएं।
6. अंडाशय के चारों ओर से सुरक्षात्मक म्यान को ध्यान से चिढ़ाने वाली सुई को पीछे से प्रत्येक अंडाशय के पूर्वकाल के अंत तक हल्के से घुमाते हुए, जबकि इसे पीछे के अंत तक संदंश की एक जोड़ी के साथ पकड़ लें।
   नोट: चिढ़ाने के दौरान नुकसान को कम करने के लिए, सुई टिप मोड़ और माइक्रोस्कोप(चित्रा 1ए)के आवर्धन में वृद्धि करके प्रत्येक अंडाशय पर ज़ूम इन । चिढ़ाने के लिए म्यान को तोड़ने के लिए काफी प्रभावी होना चाहिए, लेकिन यह भी ध्यान से ovarioles की अखंडता को बनाए रखने के लिए किया जाना चाहिए ।

Representative Results

चित्रा 1: प्रायोगिक योजना और तैयारी। (क) वर्णित तरीकों में उपयोग किए जाने वाले उपकरण: ए फ्लाई शीशी; B. कीट विच्छेदन माध्यम; C. पैराफॉर्मल्डिहाइड; D. फ्लाई ब्रश; ई. विच्छेदन पकवान; एफ कवर ग्लास; जी माइक्रोफ्यूज ट्यूब। एच ग्लास-तली डिश; I. ग्लास स्लाइड; J. 1,000-μL माइक्रोपिपेट; K. 200-μL माइक्रोपिपेट; एल 2.5-माइक्रोपिपेट माइक्रोपिपेट; एक तुला टिप के साथ एम चिढ़ा सुई (टिप बढ़ाया है); एन मोटी संदंश; हे पतली संदंश। (ख) वर्णित तरीकों का प्रतिनिधित्व करने वाला एक प्रवाह चार्ट योजनाबद्ध । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Grace's Media (Insect Dissecting Medium)	Fisher Scientific	30611031-2
41 Paraformaldehyde AQ	Electronic Microscopy Sciences	50-259-99
PolyLysine	MP Biomedicals	ICN15017625
Fly Vials	Fisher Scientific	AS-515
Fly Vial Plugs	Fisher Scientific	AS273
Jazzmix Drosophila food (Drosophila food)	Fisher Scientific	AS153
Azer Scientific EverMark Select Microscope Slides	Fisher Scientific	22-026-252
Microscope Cover Glass	Fisher Scientific	12-542-B
Mat Tek Corp Glass Bottom Mircrowell Dish	Fisher Scientific	P35G-0-14-C
Active Dried Yeast	Fisher Scientific	ICN10140001
Dumont #5 Forceps	Fine Science Technologies	11251-20
Moria Nickel Plated Pin Holder	Fine Science Technologies	26016-12
Minutien Pins	Fine Science Technologies	26002-15
MYFP ( w[*]; P{w[+mC]=sqh-EYFP-Mito}3 )	Bloomington Stock Center	7194
Fly Pad	Fly stuff	59-118
Blowgun	Fly stuff	54-104
Blowgun needle	Flystuff	54-119
Dissecting Microscope	Carl Zeiss	Stemi 2000