Melanogaster drosophila Dissecção do ovário: uma técnica para preparação de tecidos ex vivo

Overview

Este vídeo descreve a anatomia geral do ovário Drosophila e apresenta um método de dissecação de ovários para imagens vivas ou fixas.

Protocol

Este protocolo é um trecho de Parker et al., Estudando Estrutura Mitocondrial e Função em Ovários Drosophila, J. Vis. Exp. (2017).

1. Preparação de Drosophila (as ferramentas necessárias são retratadas na Figura 1A)

1. Para qualquer um dos experimentos descritos, colete Drosophila (mantida à temperatura ambiente, ou 25 °C) dentro de 5 dias de eclosão e coloque-as em um frasco cheio de 5 a 7 mL de alimentos de Drosophila (ver Tabela de Materiais),com no máximo 25 moscas em cada frasco; manter uma relação feminino:masculino de 2:1.
2. Polvilhe uma pequena quantidade de levedura granulada para estimular a produção de ovos de Drosophila. Realizar manipulação experimental dentro de 2 a 4 dias.

2. Dissecção dos ovários de Drosophila (as ferramentas necessárias são retratadas na Figura 1A)

1. Meio de dissecação de insetos quentes (ver Tabela de Materiais) à temperatura ambiente, 25 °C. Encha três poços de um prato de dissecação de vidro de oito poços, com 200 μL de meio em cada poço.
2. Anestesiar Drosophila com CO₂ colocando a agulha da arma sob o frasco. Coloque-os em uma plataforma de voo. Usando um microscópio dissecando, classifique 5 fêmeas e coloque-as no primeiro poço do prato de dissecação. Manuseie um Drosophila de cada vez ao realizar microscopia ao vivo.
3. Enquanto olha através da ocular do microscópio de dissecção, corte o tórax do abdômen usando dois pares de fórceps. Usando os fórceps, transfira cuidadosamente os abdômens para o segundo poço do prato.
4. Use um par de fórceps para segurar o abdômen na extremidade posterior, e empurre lentamente os ovários para fora (juntamente com o outro conteúdo abdominal) com o outro par de fórceps. Se esta tentativa falhar, remova cuidadosamente o exoesqueleto abdominal inserindo os fórceps na extremidade anterior para liberar os ovários.
5. Usando os fórceps, segure um ovário individual pela extremidade posterior opaca (ou seja,os ovos cheios de gema, em estágio final) e mova-o cuidadosamente para o terceiro poço do prato para provocação para processá-lo para microscopia ao vivo ou para fixação para realizar imunostaining.
6. Provoque cuidadosamente a bainha protetora ao redor dos ovários varrendo uma agulha provocante levemente da extremidade posterior para a extremidade anterior de cada ovário enquanto segura-a na extremidade posterior com um par de fórceps.
   NOTA: Para minimizar os danos durante as provocações, dobre a ponta da agulha e amplie cada ovário aumentando a ampliação do microscópio(Figura 1A). As provocações devem ser eficazes o suficiente para quebrar a bainha, mas também devem ser feitas cuidadosamente para preservar a integridade dos ovários.

Representative Results

Figura 1: Plano Experimental e Preparação. (A) Ferramentas utilizadas nos métodos descritos: A. Viado voador; B. Meio de dissecação de insetos; C. Paraformaldeído; D. Escova de mosca; E. Prato de dissecação; F. Vidro de cobertura; G. Tubo de microfuge. H. Prato com fundo de vidro; I. Deslizamento de vidro; Micropipette J. 1.000-μL; Micropipette K. 200-μL; Micropipette l. 2,5-μL; M. Agulha de provocação com ponta dobrada (a ponta é ampliada); N. Fórceps grossos; O. Fórceps finos. (B) Um esquema de fluxograma representando os métodos descritos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Grace's Media (Insect Dissecting Medium)	Fisher Scientific	30611031-2
41 Paraformaldehyde AQ	Electronic Microscopy Sciences	50-259-99
PolyLysine	MP Biomedicals	ICN15017625
Fly Vials	Fisher Scientific	AS-515
Fly Vial Plugs	Fisher Scientific	AS273
Jazzmix Drosophila food (Drosophila food)	Fisher Scientific	AS153
Azer Scientific EverMark Select Microscope Slides	Fisher Scientific	22-026-252
Microscope Cover Glass	Fisher Scientific	12-542-B
Mat Tek Corp Glass Bottom Mircrowell Dish	Fisher Scientific	P35G-0-14-C
Active Dried Yeast	Fisher Scientific	ICN10140001
Dumont #5 Forceps	Fine Science Technologies	11251-20
Moria Nickel Plated Pin Holder	Fine Science Technologies	26016-12
Minutien Pins	Fine Science Technologies	26002-15
MYFP ( w[*]; P{w[+mC]=sqh-EYFP-Mito}3 )	Bloomington Stock Center	7194
Fly Pad	Fly stuff	59-118
Blowgun	Fly stuff	54-104
Blowgun needle	Flystuff	54-119
Dissecting Microscope	Carl Zeiss	Stemi 2000