Overview
Este vídeo descreve a anatomia geral do ovário Drosophila e apresenta um método de dissecação de ovários para imagens vivas ou fixas.
Protocol
Este protocolo é um trecho de Parker et al., Estudando Estrutura Mitocondrial e Função em Ovários Drosophila, J. Vis. Exp. (2017).
1. Preparação de Drosophila (as ferramentas necessárias são retratadas na Figura 1A)
- Para qualquer um dos experimentos descritos, colete Drosophila (mantida à temperatura ambiente, ou 25 °C) dentro de 5 dias de eclosão e coloque-as em um frasco cheio de 5 a 7 mL de alimentos de Drosophila (ver Tabela de Materiais),com no máximo 25 moscas em cada frasco; manter uma relação feminino:masculino de 2:1.
- Polvilhe uma pequena quantidade de levedura granulada para estimular a produção de ovos de Drosophila. Realizar manipulação experimental dentro de 2 a 4 dias.
2. Dissecção dos ovários de Drosophila (as ferramentas necessárias são retratadas na Figura 1A)
- Meio de dissecação de insetos quentes (ver Tabela de Materiais) à temperatura ambiente, 25 °C. Encha três poços de um prato de dissecação de vidro de oito poços, com 200 μL de meio em cada poço.
- Anestesiar Drosophila com CO2 colocando a agulha da arma sob o frasco. Coloque-os em uma plataforma de voo. Usando um microscópio dissecando, classifique 5 fêmeas e coloque-as no primeiro poço do prato de dissecação. Manuseie um Drosophila de cada vez ao realizar microscopia ao vivo.
- Enquanto olha através da ocular do microscópio de dissecção, corte o tórax do abdômen usando dois pares de fórceps. Usando os fórceps, transfira cuidadosamente os abdômens para o segundo poço do prato.
- Use um par de fórceps para segurar o abdômen na extremidade posterior, e empurre lentamente os ovários para fora (juntamente com o outro conteúdo abdominal) com o outro par de fórceps. Se esta tentativa falhar, remova cuidadosamente o exoesqueleto abdominal inserindo os fórceps na extremidade anterior para liberar os ovários.
- Usando os fórceps, segure um ovário individual pela extremidade posterior opaca (ou seja,os ovos cheios de gema, em estágio final) e mova-o cuidadosamente para o terceiro poço do prato para provocação para processá-lo para microscopia ao vivo ou para fixação para realizar imunostaining.
- Provoque cuidadosamente a bainha protetora ao redor dos ovários varrendo uma agulha provocante levemente da extremidade posterior para a extremidade anterior de cada ovário enquanto segura-a na extremidade posterior com um par de fórceps.
NOTA: Para minimizar os danos durante as provocações, dobre a ponta da agulha e amplie cada ovário aumentando a ampliação do microscópio(Figura 1A). As provocações devem ser eficazes o suficiente para quebrar a bainha, mas também devem ser feitas cuidadosamente para preservar a integridade dos ovários.
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Representative Results
Figura 1: Plano Experimental e Preparação. (A) Ferramentas utilizadas nos métodos descritos: A. Viado voador; B. Meio de dissecação de insetos; C. Paraformaldeído; D. Escova de mosca; E. Prato de dissecação; F. Vidro de cobertura; G. Tubo de microfuge. H. Prato com fundo de vidro; I. Deslizamento de vidro; Micropipette J. 1.000-μL; Micropipette K. 200-μL; Micropipette l. 2,5-μL; M. Agulha de provocação com ponta dobrada (a ponta é ampliada); N. Fórceps grossos; O. Fórceps finos. (B) Um esquema de fluxograma representando os métodos descritos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Grace's Media (Insect Dissecting Medium) | Fisher Scientific | 30611031-2 | |
41 Paraformaldehyde AQ | Electronic Microscopy Sciences | 50-259-99 | |
PolyLysine | MP Biomedicals | ICN15017625 | |
Fly Vials | Fisher Scientific | AS-515 | |
Fly Vial Plugs | Fisher Scientific | AS273 | |
Jazzmix Drosophila food (Drosophila food) | Fisher Scientific | AS153 | |
Azer Scientific EverMark Select Microscope Slides | Fisher Scientific | 22-026-252 | |
Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-542-B | |
Mat Tek Corp Glass Bottom Mircrowell Dish | Fisher Scientific | P35G-0-14-C | |
Active Dried Yeast | Fisher Scientific | ICN10140001 | |
Dumont #5 Forceps | Fine Science Technologies | 11251-20 | |
Moria Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Technologies | 26016-12 | |
Minutien Pins | Fine Science Technologies | 26002-15 | |
MYFP ( w[*]; P{w[+mC]=sqh-EYFP-Mito}3 ) | Bloomington Stock Center | 7194 | |
Fly Pad | Fly stuff | 59-118 | |
Blowgun | Fly stuff | 54-104 | |
Blowgun needle | Flystuff | 54-119 | |
Dissecting Microscope | Carl Zeiss | Stemi 2000 |