Drosophila melanogaster (olika betydelser) Äggstocksav dissekering: En teknik för ex Vivo vävnadspreparat

Overview

Denna video beskriver den allmänna anatomin hos Drosophila äggstocken och har en metod för dissekering äggstockar för levande eller fast bildbehandling.

Protocol

Detta protokoll är ett utdrag från Parker et al., Studying Mitochondrial Structure and Function in Drosophila Ovaries, J. Vis. Exp. (2017).

1. Beredning av Drosophila (de verktyg som krävs visas i figur 1A)

1. För något av de beskrivna experimenten, samla Drosophila (bibehållen vid rumstemperatur eller 25 °C) inom 5 dagar efter eklosion och placera dem i en flaska fylld med 5- 7 ml Drosophila-mat (se materialförteckning),med högst 25 flugor i varje flaska; upprätthålla ett kvinnligt:manligt förhållande på 2:1.
2. Strö en liten mängd granulerad jäst för att stimulera Drosophila äggproduktion. Utför experimentell manipulation inom 2 - 4 dagar.

2. Dissekering av Drosophila äggstockar (de verktyg som krävs visas i figur 1A)

1. Varmt insektsavsekverande medium (se Materialförteckning)till rumstemperatur, 25 °C. Fyll tre brunnar av en åtta brunns glas dissekeringsform, med 200 μL medium i varje brunn.
2. Bedöva Drosophila med CO_{2 genom} att placera nålen på blåspistolen under injektionsflaskan. Lägg dem på en flygplatta. Använd ett dissekerande mikroskop, sortera ut 5 honor och placera dem i den första brunnen i dissekeringsrätten. Hantera en Drosophila i taget när du utför levande mikroskopi.
3. Medan du tittar genom dissektionsmikroskopets okular, skär bröstkorgen från buken med två par tång. Använd tången, överför försiktigt buken till skålens andra brunn.
4. Använd ett par tång för att hålla buken i den bakre änden och tryck långsamt äggstockarna ut (tillsammans med det andra bukinnehållet) med det andra paret tång. Om detta försök misslyckas, ta försiktigt bort bukexoskelettet genom att föra in tången i den främre änden för att frigöra äggstockarna.
5. Använd tången, håll en enskild äggstock vid den ogenomskinliga bakre änden(dvs.äggulafyllda, sena ägg) och flytta den försiktigt till den tredje brunnen i skålen för retande för att bearbeta den för levande mikroskopi eller för fixering för att utföra immunostaining.
6. Reta försiktigt den skyddande mantlen från runt äggstockarna genom att svepa en retsticka lätt från bakre till den främre änden av varje äggstock medan du håller den i den bakre änden med ett par tångar.
   OBS: För att minimera skador under retning, böj nålspetsen och zooma in på varje äggstock genom att öka förstoringen av mikroskopet(bild 1A). Retning bör vara tillräckligt effektivt för att bryta mantlan, men det bör också göras noggrant för att bevara ovariolens integritet.

Representative Results

Figur 1: Experimentell plan och förberedelse. a) Verktyg som används i de beskrivna metoderna: A. Flygflaska. B. Insekt dissekeringsmedium; C. Paraformaldehyd; D. Flygborste; E. Dissekeringsfat; F. Täckglas; G. Microfuge rör. H. Skål med glasbotten; I. Glasrutschbana; J. 1 000-μL mikropipett; K. 200-μL mikropipett; L. 2,5-μL mikropipett; M. Retas nål med en böjd spets (spetsen är förstorad); N. Tjocka tångar; O. Tunna tångar. B) Ett flödesschema som representerar de beskrivna metoderna. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Grace's Media (Insect Dissecting Medium)	Fisher Scientific	30611031-2
41 Paraformaldehyde AQ	Electronic Microscopy Sciences	50-259-99
PolyLysine	MP Biomedicals	ICN15017625
Fly Vials	Fisher Scientific	AS-515
Fly Vial Plugs	Fisher Scientific	AS273
Jazzmix Drosophila food (Drosophila food)	Fisher Scientific	AS153
Azer Scientific EverMark Select Microscope Slides	Fisher Scientific	22-026-252
Microscope Cover Glass	Fisher Scientific	12-542-B
Mat Tek Corp Glass Bottom Mircrowell Dish	Fisher Scientific	P35G-0-14-C
Active Dried Yeast	Fisher Scientific	ICN10140001
Dumont #5 Forceps	Fine Science Technologies	11251-20
Moria Nickel Plated Pin Holder	Fine Science Technologies	26016-12
Minutien Pins	Fine Science Technologies	26002-15
MYFP ( w[*]; P{w[+mC]=sqh-EYFP-Mito}3 )	Bloomington Stock Center	7194
Fly Pad	Fly stuff	59-118
Blowgun	Fly stuff	54-104
Blowgun needle	Flystuff	54-119
Dissecting Microscope	Carl Zeiss	Stemi 2000