Drosophila melanogaster Yumurtalık Diseksiyonu: Ex Vivo Doku Hazırlama tekniği

Overview

Bu video Drosophila yumurtalığının genel anatomisini açıklar ve canlı veya sabit görüntüleme için yumurtalıkları parçalama yöntemine sahiptir.

Protocol

Bu protokol, Drosophila Yumurtalıklarında Mitokondriyal Yapı ve İşlevi Inceleyen Parker ve ark., J. Vis. Exp. (2017)'den bir alıntıdır.

1. Drosophila'nın hazırlanması (gerekli araçlar Şekil 1A'datasvir edilir)

1. Açıklanan deneylerden herhangi biri için, Drosophila'yı (oda sıcaklığında veya 25 ° C'de tutulur) eklozyondan sonraki 5 gün içinde toplayın ve her şişede 25'ten fazla sinek olmadan 5 - 7 mL Drosophila yiyeceği ile dolu bir şişeye yerleştirin (bkz. Malzeme Masası); kadın:erkek oranını 2:1 olarak koruyun.
2. Drosophila yumurta üretimini teşvik etmek için az miktarda toz maya serpin. 2 - 4 gün içinde deneysel manipülasyon gerçekleştirin.

2. Drosophila Yumurtalıklarının Diseksiyonu (gerekli araçlar Şekil 1A'datasvir edilir)

1. Sıcak böcek diseksiyon ortamı (bkz. Malzeme Tablosu)oda sıcaklığına, 25 °C. Her kuyuda 200 μL orta ile sekiz kuyulu bir cam diseksiyon kabının üç kuyusunu doldurun.
2. Üfleme tabancasının iğnesini şişe fişinin altına yerleştirerek Drosophila'yı CO₂ ile uyuşturun. Onları bir sineklik üzerine yerleştirin. Bir diseksiyon mikroskobu kullanarak, 5 dişiyi sıralayın ve diseksiyon kabının ilk kuyusuna yerleştirin. Canlı mikroskopi yaparken bir seferde bir Drosophila'yı ele alın.
3. Diseksiyon mikroskopunun göz merceğinden bakarken, iki çift tostipi kullanarak toraksı karından koparın. Tokmakları kullanarak, karınları dikkatlice yemeğin ikinci kuyusuna aktarın.
4. Karnı arka uçta tutmak için bir çift tokmak kullanın ve yumurtalıkları yavaşça dışarı itin (diğer karın içeriğiyle birlikte) diğer bir çift asa ile birlikte. Bu girişim başarısız olursa, yumurtalıkları serbest bırakmak için ön uca ön uç içine tokmakları yerleştirerek karın dış iskeletini dikkatlice çıkarın.
5. Forseps kullanarak, opak arka ucundan(yaniyumurta sarısı dolu, geç aşama yumurtalar) tek bir yumurtalığı tutun ve canlı mikroskopi için işlemek veya immünostaining yapmak için sabitlemek için yemeğin üçüncü kuyusuna dikkatlice taşıyın.
6. Koruyucu kılıfı, bir çift ön uçla arka ucundan tutarken, her yumurtalığın arka ucundan ön ucuna hafifçe süpürerek yumurtalıkların etrafından dikkatlice alay edin.
   NOT: Alay sırasında hasarı en aza indirmek için, mikroskobun büyütmesini artırarak iğne ucunu bükün ve her yumurtalığı yakınlaştırın (Şekil 1A). Alay etmek kılıfeti kıracak kadar etkili olmalıdır, ancak yumurtalıkların bütünlüğünü korumak için de dikkatlice yapılmalıdır.

Representative Results

Şekil 1: Deneysel Plan ve Hazırlık. (A) Açıklanan yöntemlerde kullanılan aletler: A. Sinek şişesi; B. Böcek diseksiyon ortamı; C. Paraformaldehit; D. Sinek fırçası; E. Diseksiyon kabı; F. Kapak camı; G. Mikroyakıt tüpü. H. Cam tabanlı tabak; I. Cam slayt; J. 1.000-μL mikropipette; K. 200-μL mikropipette; L. 2.5-μL mikropipette; M. Bükülmüş uçlu alay iğnesi (ucu büyütülmüştür); N. Kalın kümesler; O. İnce sıyrıklar. (B) Açıklanan yöntemleri temsil eden bir akış şeması şeması. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Grace's Media (Insect Dissecting Medium)	Fisher Scientific	30611031-2
41 Paraformaldehyde AQ	Electronic Microscopy Sciences	50-259-99
PolyLysine	MP Biomedicals	ICN15017625
Fly Vials	Fisher Scientific	AS-515
Fly Vial Plugs	Fisher Scientific	AS273
Jazzmix Drosophila food (Drosophila food)	Fisher Scientific	AS153
Azer Scientific EverMark Select Microscope Slides	Fisher Scientific	22-026-252
Microscope Cover Glass	Fisher Scientific	12-542-B
Mat Tek Corp Glass Bottom Mircrowell Dish	Fisher Scientific	P35G-0-14-C
Active Dried Yeast	Fisher Scientific	ICN10140001
Dumont #5 Forceps	Fine Science Technologies	11251-20
Moria Nickel Plated Pin Holder	Fine Science Technologies	26016-12
Minutien Pins	Fine Science Technologies	26002-15
MYFP ( w[*]; P{w[+mC]=sqh-EYFP-Mito}3 )	Bloomington Stock Center	7194
Fly Pad	Fly stuff	59-118
Blowgun	Fly stuff	54-104
Blowgun needle	Flystuff	54-119
Dissecting Microscope	Carl Zeiss	Stemi 2000