Malpighian Tubule Dissektion fra en voksen Fly: Isolere en Osmoregulatory og Udskillelse Organ

Overview

Denne artikel beskriver dissektion af den forreste malpighian tubules (MT) fra en kvindelig Drosophila flyve og et eksempel protokol fra Rossano et al. (2017), hvor MT'erne forberedes til levende billeddannelse i et perfusionskammer.

Protocol

Denne protokol er et uddrag fra Rossano og Romero, optisk kvantificering af intracellulær pH i Drosophila melanogaster Malpighian Tubule Epithelia med en fluorescerende genetisk kodet pH-indikator, J. Vis. Exp. (2017).

1. Forberedelse af Poly-L-Lysin Slides

1. Tegn en 40 x 20 mm kant med en hydrofob PAP pen rundt om toppen af standard 75 x 25 mm dias og der er afsat til at tørre i 15 min på RT. Brug store coverslips, hvis diasene ikke er kompatible med billeddannelse optik.
2. Overfør 2 ml lager 0,01% Poly-L-Lysine (PLL) opløsning på hvert dias og der er afsat til 1 time på RT.
3. Fjern overskydende PLL med en pipette. Gem opløsningen i et 50 ml konisk hætteglas til fremtidig brug. Opbevares ved 4 °C.
4. Indsug eventuel resterende opløsning med en vakuumledning. Kør vakuumlinjen over hele diasoverfladen for at sikre, at der ikke er nogen løsning tilbage på diasene.
5. Sæt diasene til side til 1 ekstra h ved RT før brug. Opbevar diasene tørre på RT i op til 1 måned i en standarddiasbog.

2. Fremstilling af dissekeringsskål og glasstænger

1. Der tilsættes 0,5 mL elastomerhærdningsmiddel til 4,5 mL elastomerbase i en 35 x 10 mm polystyren petriskål ved RT for at producere en dybde på 5 mm. Bland med en engangs pipette spids. Lad elastomer helbrede O/N ved RT.
   BEMÆRK: Elastomer skal være fri og fri for bobler. Rydning af bobler kan lettes ved at holde elastomerplader i en vakuumkrukke i 10 - 15 minutter efter hældning.
2. Hold en glasstang med en diameter på 5 mm mellem hænderne, og smelt midten af stangen over en tændt Bunsen-brænder, mens du trækker enderne fra hinanden. Efterhånden som glasset smelter trække hurtigere til at producere en tynd (0,1 mm) og koniske aksel(Figur 1).
   BEMÆRK: En vinkel på 45 ° ved skaftet er ofte nyttig til håndtering af tubules. Dette kan opnås ved at sænke den ene hånd, når skaftet trækkes (se figur 1).
3. Bryd den tynde aksel i midten med den stumpe side af et enkeltkantet karbonstål barberblad. Undersøg den tynde ende af stangen under et dissekeringsomfang for at sikre, at pausen er ren.

3. Dissektion af voksne Drosophila Anterior Malpighian Tubules

1. Saml dissektionsskålen og den trukket glasstang fra afsnit 2, et PLL-belagt dias fra sektion 1, en klæbende perfusionsbrøndsdeler, vakuumfedt, en 4 x 2" strimmel tætningsfilm, 2 par #5 fine pincet og 40 mL aliquots af iskold Schneiders medium og RT iPBS.
2. Spred vakuumfedt på tætningsbåndet og tryk klæbebåndet perfusion-godt skillevæg på båndet for at belægge bunden med fedt. Skræl den selvklæbende perfusion-godt skillevæg og læg den fedt-side-down på toppen af en PLL belagt dias. Fjern perfusionsbrønddeleren for at efterlade individuelle prøvebrønde spores i hydrofobisk fedt.
3. Placer 200 μL RT iPBS i den fedtomkransede brønd på den PLL-belagte rutsjebane, og flyt rutsjebanen under stereoskopet.
4. Placer UAS-pHerry/capaR-GAL4 fluer i en tom flyve hætteglas og bedøve dem på is i 10 min.
   BEMÆRK: Denne metode til anæstesi, i modsætning til CO₂, sikrer, at fluerne ikke dehydrerer.
5. Hæld iskold Schneiders medium i dissekeringsskålen og brug fine pincet til at overføre en enkelt bedøvet kvindelig flyve ind i skålen under et dissekerende stereoskop.
6. Hold fluen ved brystkassen med et sæt pincet og brug den anden til forsigtigt at gribe fat i mavens bagdel. Træk den bageste del af fluen op ved hjælp af tangen i korte, bevidste bevægelser. Når baggut er synlig, greb distale ende og frigør tarmen og MTs fra de underliggende trakeler ved at trække bagdug væk fra kroppen gennem gentagne, korte slæbebåde.
   BEMÆRK: De forreste og bageste MT'er vil være synlige, hvor de møder krydset mellemtone og bagdug gennem ureteren. Det første par MT'er, der er gratis, vil sandsynligvis være de bageste tubules, når de omkranser baggutten. Disse kan ignoreres (figur 2A).
7. Pinch off den forreste MTs på ureter med fine pincet, når det andet sæt af MTs er fri for maven. Dette vil adskille de forreste MT'er fra tarmen og lukke ureteren.
8. Pick up den frie forreste MTs med trukket glas stang ved at skubbe stangen under ureter sådan, at tubules falder til begge sider. Løft MT'erne lige op af opløsningen.
9. Drej glasstangen på en sådan måde, at MT'erne og ureteren klæbes til undersiden af stangen, og sænk uret lige ned på rutsjebanen. Påsætte ureteren og forsegle MT'ernes distale ender ved at trykke ureteren ned på glasrutsjebanen (Figur 2B). Må ikke manipulere MTs noget mere end nødvendigt. MT'erne skal flyde op i opløsningen med ureter forankret til diaset.
10. Brug den fine ende af glasstangen til forsigtigt at feje hver tubule over diasoverfladen. Afstiv stangen mod rutsjebanen for at undgå at knuse slangen og skub stangen over toppen af tubule, bevæger distal til proksimal, for at fastgøre den fulde længde af hver tubule til overfladen af PLL-belagt dias(Figur 2C).
11. Placer klæbemiddel perfusion-godt skillevæg tilbage på diaset til at danne en lille væskefyldt godt over den monterede tubule.
12. Placer prøven på mikroskopstadiet. Placer ind- og udstrømningskapillærerne over henholdsvis ind- og udløbsåbningen af perfusionsbrønden.
    BEMÆRK: Brønddeleren kan slukkes, hvis der ønskes et åbent perfusionskammer. I dette tilfælde kan ind- og udstrømningskapillærerne justeres til modsatte sider af en billedbrønd.

Representative Results

Figur 1: Fremstilling af glasstænger til håndtering af malpighiske tubules.
A - E. Opvarmning og træk af en glasstang for at producere en konus og vinkel, der er egnet til håndtering af MT'er. Pile angiver retning og kraftstyrke, der skal påføres. F.Fotografi af et passende fremstillet glasværktøj. Skalalinje = 10 mm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2: Dissektion af voksne Drosophila Anterior Malpighian Tubules.
A. Skematisk repræsentation af forreste MT fjernelse med 2 par fine pincet i kølet Schneider's medium. "A. Tubule" = Forreste MT. "P. Tubule" = bageste MT. B. Processen med at hente og montere ekstraherede MT'er ved hjælp af tynde glasstænger. C. Processen med at klæbe hele længden af ekstraherede MT'er til et dias til billeddannelse og fysiologisk vurdering. D.Repræsentative widefield-billeder af SEpH-komponenterne (470/510 nm ex/em) og mCherry (556/630 nm ex/em) af UAS-pHerry drevet af capaR-GAL4, der viser sunde forreste MT'er forreste MTs beskadiget af utilstrækkelig perfusion, og fejlidentificeret posterior MTs. Bemærk, at sunde forreste MTs vise en klar udvidet blind indledende segment, en indsnævret overgangssegment med relativt øget udtryk for UAS-pHerry når drevet af capaR-GAL4, og en distal hovedsegment. Beskadigede MT'er viser mærkbare aggregater af mCherry-fluorescens uden tilsvarende SEpH-fluorescens. Bageste MT'er er ensartede i diameter uden morfologisk adskilte segmenter. Skalalinje = 50 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Poly-L-Lysine (PLL) Solution	Sigma-Aldrich	P4832	Store at 4 °C, can be reused.
Adhesive Perfusion Chamber Covers, adhesive size 1 mm, chamber diameter × thickness 9 mm × 0.9 mm, ports diameter 1.5 mm	Sigma-Aldrich	GBL622105	Can be substituted as needed to match perfusion system.
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Ellsworth Adhesives	184 SIL ELAST KIT 0.5KG	Available from multiple vendors.
Helping Hands Soldering Stands	Harbor Freight Tools	60501	Available from multiple vendors.
Schneider's Medium	Fisher Scientific	21720024	Store at 4 °C in sterile aliquots.
#5 Inox Steel Forceps	Fine Science Tools	11252-20	Can be substituted based on experimenter comfort.
35 x 10 mm polystyrene Petri dish	Corning Life Sciences	Fisher Scientific 08-757-100A	Exact brand and size are unimportant.
75 x 25 mm Microscope Slides	Corning Life Sciences	2949-75X25	Exact brand and size can vary as long as perfusion wells are compatible.
Filimented Borosilicate Capillary Glass, ID 1.5 mm, OD 0.86 mm, thickness 0.32 mm	Warner Instruments	64-0796	Filiment not necessary, glass can be substituted to match perfusion tubing and perfusion wells.
Vacuum Silicone Grease	Sigma-Aldrich	Z273554	Available from multiple vendors.
Glass rods, 5 mm diameter	delphiglass.com	9198	Exact size is personal preference, multiple vendors available
PAP Hydrophobic Pen	Sigma-Aldrich	Z377821	Available from multiple vendors.
Sealing Film	Sigma-Aldrich	P7668	Available from multiple vendors.
15 mL Falcon tube	BD Falcon	352096	Available from multiple vendors.
50 mL Falcon tube	BD Falcon	352070	Available from multiple vendors.
Dissecting Stereoscope	Zeiss	Discovery.V8	Any dissecting stereoscope can be used.
UAS-pHerry transgenic Drosophila melagnogaster	Available from Romero Lab		First published: Rossano et al., 2017
capaR-GAL4 driver line Drosophila melagnogaster	Available from Romero Lab		First published: Terhzaz et al., 2012
c724-GAL4 driver line Drosophila melagnogaster	Available from Romero Lab		First published: Sozen et al., 1997
Single-edged Carbon Steel Razor Blade	Electron Microscopy Sciences	71960	Available from multiple vendors.
Microscopy Slide Folder	Fisher Scientific	16-04	Available from multiple vendors.
Bunsen Burner	Fisher Scientific	50-110-1231	Available from multiple vendors.
Polystrene Drosophila Rearing Vials with Flugs	Genesee Scientific	32-109BF	Comparable items can be substituted.
2.5 L Laboratory Ice Bucket	Fisher Scientific	07-210-129	Available from multiple vendors.
200 uL barrier pipette tips	MidSci	AV200	Available from multiple vendors.
200 μL variable volume pipette	Gilson Incorporated	PIPETMAN P200	Available from multiple vendors.