Malpighian Tubule Dissectie van een Volwassen Vlieg: Het isoleren van een Osmoregulatory en Excretory Orgaan

Overview

Dit artikel beschrijft de dissectie van de voorste Malinese tubuli (MT) van een vrouwelijke Drosophila-vlieg en een voorbeeldprotocol van Rossano et al. (2017) waarin de MT's worden voorbereid op live beeldvorming in een perfusiekamer.

Protocol

Dit protocol is een fragment uit Rossano en Romero, Optical Quantification of Intracellular pH in Drosophila melanogaster Malpighian Tubule Epithelia with a Fluorescent Genetically-encoded pH Indicator, J. Vis. Exp. (2017).

1. Voorbereiding van Poly-L-Lysine Dia's

1. Teken een rand van 40 x 20 mm met een hydrofobe PAP-pen rond de bovenkant van standaard dia's van 75 x 25 mm en zet opzij om 15 minuten te drogen bij RT. Gebruik grote coverslips als de dia's niet compatibel zijn met beeldoptica.
2. Breng 2 ml voorraad 0,01% Poly-L-Lysine (PLL) oplossing over op elke dia en zet deze 1 uur opzij bij RT.
3. Verwijder overtollige PLL met een pipet. Bewaar de oplossing in een conische flacon van 50 ml voor toekomstig gebruik. Bewaren bij 4 °C.
4. Aspireer de resterende oplossing met een vacuümlijn. Voer de vacuümlijn over het hele diaoppervlak uit om ervoor te zorgen dat er geen oplossing op de dia's achter blijft.
5. Zet de dia's voor gebruik 1 uur extra opzij bij RT. Bewaar de dia's maximaal 1 maand droog bij RT in een standaard diaboek.

2. Bereiding van dissectieschaal en glazen staven

1. Voeg 0,5 ml elastomeeruithardingsmiddel toe aan 4,5 ml elastomeerbasis in een polystyreen petrischaal van 35 x 10 mm bij RT om een diepte van 5 mm te produceren. Meng met een wegwerppipettip. Laat elastomeer O/N genezen bij RT.
   OPMERKING: Elastomeer moet helder en vrij van bellen zijn. Het verwijderen van bellen kan worden vergemakkelijkt door elastomeerplaten na het gieten 10 - 15 minuten in een vacuümpot te bewaren.
2. Houd een glazen staaf met een diameter van 5 mm tussen de handen en smelt het midden van de staaf over een verlichte Bunsen-brander terwijl u de uiteinden uit elkaar trekt. Naarmate het glas smelt, trekt het sneller om een dunne (0,1 mm) en taps toelopende as te produceren (figuur 1).
   OPMERKING: Een hoek van 45 ° aan de schacht is vaak nuttig bij het hanteren van tubuli. Dit kan worden bereikt door één hand te laten zakken terwijl de schacht wordt getrokken (zie figuur 1).
3. Breek de dunne schacht in het midden met de stompe kant van een enkelzijdig scheermesje van koolstofstaal. Inspecteer het dunne uiteinde van de staaf onder een ontleedbereik om er zeker van te zijn dat de breuk schoon is.

3. Dissectie van volwassen drosophila anterieure Malinese tubuli

1. Verzamel de dissectieschaal en de getrokken glazen staaf van sectie 2, een PLL-gecoate glijbaan van sectie 1, een zelfklevende perfusieputverdeler, vacuümvet, een 4 x 2" strook afdichtingsfolie, 2 paar #5 fijne tang en 40 ml aliquots ijskoud Schneiders medium en RT iPBS.
2. Smeer vacuümvet op de afdichtingstape en druk de zelfklevende perfusie-putverdeler op de tape om de bodem met vet te coaten. Verwijder de zelfklevende perfusie-putverdeler en plaats deze vetzijdig op een PLL-gecoate glijbaan. Verwijder de perfusie-putverdeler om afzonderlijke monsterputten te laten traceren in hydrofoob vet.
3. Plaats 200 μL RT iPBS in de met vet omcirkelde put op de PLL-gecoate glijbaan en beweeg de glijbaan onder de stereoscope.
4. Plaats UAS-pHerry/capaR-GAL4 vliegen in een lege vliegenflacon en verdoof ze gedurende 10 minuten op ijs.
   OPMERKING: Deze anesthesiemethode zorgt er, in tegenstelling tot CO_2,voor dat de vliegen niet uitdrogen.
5. Giet het medium van de ijskoude Schneider in de ontleedschaal en gebruik fijne tangen om een enkele verdoofde vrouwelijke vlieg in de schaal over te brengen onder een ontledende stereoscope.
6. Houd de vlieg bij de thorax met een set tangen en gebruik de andere om de achterste van de buik voorzichtig vast te pakken. Trek de achterste van de vlieg open met behulp van de tang in korte, opzettelijke bewegingen. Zodra de hindgut zichtbaar is, grijpt u het distale uiteinde vast en bevrijdt u de darm en MT's van de onderliggende luchtpijpen door de hindgut van het lichaam af te trekken door repetitieve, korte sleepboten.
   OPMERKING: De voorste en achterste MST's zullen zichtbaar zijn waar ze de kruising van de midgut en hindgut door de ureter ontmoeten. Het eerste paar MT's dat vrij is, zijn waarschijnlijk de achterste tubuli terwijl ze de achterhand omringen. Deze kunnen worden genegeerd (figuur 2A).
7. Knijp de voorste MT's in de ureter af met een fijne tang zodra de tweede set MT's vrij is van de buik. Dit scheidt de voorste MST's van de darm en sluit de ureter.
8. Pak de vrije voorste MT's op met de getrokken glazen staaf door de staaf onder de ureter te schuiven, zodat de tubuli naar beide kanten vallen. Til de MT's recht omhoog uit de oplossing.
9. Draai de glazen staaf zodanig dat de MT's en de ureter aan de onderkant van de stang zijn vastgenaaid en laat de ureter recht naar beneden op de glijbaan zakken. Breng de ureter aan en verzegel de distale uiteinden van de MT's door de ureter op de glazen glijbaan te drukken (afbeelding 2B). Manipuleer de MT's niet meer dan nodig is. De MT's moeten omhoog drijven in de oplossing met de ureter verankerd aan de dia.
10. Gebruik het fijne uiteinde van de glazen staaf om elke buis voorzichtig over het schuifoppervlak te vegen. Zet de stang tegen de glijbaan om te voorkomen dat de buis wordt verbrijzeld en schuif de staaf over de bovenkant van de buis, waarbij deze distaal naar proximaal beweegt, om de volledige lengte van elke tubulus aan het oppervlak van de met PLL beklede glijbaan te bevestigen (afbeelding 2C).
11. Plaats de zelfklevende perfusie-putverdeler terug op de glijbaan om een kleine met vloeistof gevulde put over de gemonteerde buis te vormen.
12. Plaats het monster op het microscoopstadium. Plaats de in- en uitstroomcapillairen respectievelijk over de inlaat- en uitlaatopening van de perfusieput.
    OPMERKING: De putverdeler kan worden weggelaten als een open perfusiekamer gewenst is. In dit geval kunnen de in- en uitstroomcapillairen worden uitgelijnd op tegenovergestelde zijden van een beeldvormingsput.

Representative Results

Figuur 1: Het fabriceren van glazen staven voor het hanteren van Malinese tubuli.
A - E. Proces van verwarmen en trekken van een glazen staaf om een taps toelopende en hoek te produceren die geschikt is voor het hanteren van ST's. Pijlen geven de richting en de omvang van de kracht aan die moet worden toegepast. F. Foto van een op de juiste manier vervaardigd glasgereedschap. Schaalbalk = 10 mm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 2: Dissectie van volwassen Drosophila Anterior Malpighian Tubuli.
A. Schematische weergave van voorste MT verwijdering met 2 paar fijne tangen in gekoeld Schneider's medium. "A. Tubule" = Voorste MT. "P. Tubule" = achterste MT. B. Proces van het ophalen en monteren van geëxtraheerde MT's met behulp van dunne glazen staven. C. Proces van het vasthouden van de volledige lengte van geëxtraheerde MST's aan een dia voor beeldvorming en fysiologische beoordeling. D. Representatieve widefield-beelden van de componenten SEpH (470/510 nm ex/em) en mCherry (556/630 nm ex/em) van UAS-pHerry aangedreven door capaR-GAL4 met gezonde voorste MT's, anterieure MT's beschadigd door onvoldoende perfusie, en verkeerd geïdentificeerde posterieure MT's. Merk op dat gezonde voorste MT's een duidelijk verwijd blind beginsegment vertonen, een vernauwd overgangssegment met relatief verhoogde expressie van UAS-pHerry wanneer aangedreven door capaR-GAL4, en een distaal hoofdsegment. Beschadigde MT's vertonen merkbare aggregaten van mCherry fluorescentie zonder overeenkomstige SEpH fluorescentie. Posterieure MT's zijn uniform in diameter zonder morfologisch verschillende segmenten. Schaalbalk = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Poly-L-Lysine (PLL) Solution	Sigma-Aldrich	P4832	Store at 4 °C, can be reused.
Adhesive Perfusion Chamber Covers, adhesive size 1 mm, chamber diameter × thickness 9 mm × 0.9 mm, ports diameter 1.5 mm	Sigma-Aldrich	GBL622105	Can be substituted as needed to match perfusion system.
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Ellsworth Adhesives	184 SIL ELAST KIT 0.5KG	Available from multiple vendors.
Helping Hands Soldering Stands	Harbor Freight Tools	60501	Available from multiple vendors.
Schneider's Medium	Fisher Scientific	21720024	Store at 4 °C in sterile aliquots.
#5 Inox Steel Forceps	Fine Science Tools	11252-20	Can be substituted based on experimenter comfort.
35 x 10 mm polystyrene Petri dish	Corning Life Sciences	Fisher Scientific 08-757-100A	Exact brand and size are unimportant.
75 x 25 mm Microscope Slides	Corning Life Sciences	2949-75X25	Exact brand and size can vary as long as perfusion wells are compatible.
Filimented Borosilicate Capillary Glass, ID 1.5 mm, OD 0.86 mm, thickness 0.32 mm	Warner Instruments	64-0796	Filiment not necessary, glass can be substituted to match perfusion tubing and perfusion wells.
Vacuum Silicone Grease	Sigma-Aldrich	Z273554	Available from multiple vendors.
Glass rods, 5 mm diameter	delphiglass.com	9198	Exact size is personal preference, multiple vendors available
PAP Hydrophobic Pen	Sigma-Aldrich	Z377821	Available from multiple vendors.
Sealing Film	Sigma-Aldrich	P7668	Available from multiple vendors.
15 mL Falcon tube	BD Falcon	352096	Available from multiple vendors.
50 mL Falcon tube	BD Falcon	352070	Available from multiple vendors.
Dissecting Stereoscope	Zeiss	Discovery.V8	Any dissecting stereoscope can be used.
UAS-pHerry transgenic Drosophila melagnogaster	Available from Romero Lab		First published: Rossano et al., 2017
capaR-GAL4 driver line Drosophila melagnogaster	Available from Romero Lab		First published: Terhzaz et al., 2012
c724-GAL4 driver line Drosophila melagnogaster	Available from Romero Lab		First published: Sozen et al., 1997
Single-edged Carbon Steel Razor Blade	Electron Microscopy Sciences	71960	Available from multiple vendors.
Microscopy Slide Folder	Fisher Scientific	16-04	Available from multiple vendors.
Bunsen Burner	Fisher Scientific	50-110-1231	Available from multiple vendors.
Polystrene Drosophila Rearing Vials with Flugs	Genesee Scientific	32-109BF	Comparable items can be substituted.
2.5 L Laboratory Ice Bucket	Fisher Scientific	07-210-129	Available from multiple vendors.
200 uL barrier pipette tips	MidSci	AV200	Available from multiple vendors.
200 μL variable volume pipette	Gilson Incorporated	PIPETMAN P200	Available from multiple vendors.